牛副結(jié)核病診斷方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、牛副結(jié)核病是由副結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性消化系統(tǒng)疾病，副結(jié)核分枝桿菌能引起感染牛的產(chǎn)奶量下降、持續(xù)性消瘦、頑固性下痢甚至死亡，給畜牧業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)有研究表明該菌與人的克羅恩病有關(guān)，因此該病引起了研究人員越來(lái)越多的關(guān)注。副結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，具有較強(qiáng)的環(huán)境抵抗力，牛通常在幼年期經(jīng)口感染該菌并具有一個(gè)較長(zhǎng)的亞臨床期，后期才表現(xiàn)出臨床癥狀。目前對(duì)于牛副結(jié)核病尚無(wú)有效的治療方法，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并淘汰感染牛是凈化牛場(chǎng)最有效的方法

2、，由于機(jī)體感染該菌后存在細(xì)胞免疫與體液免疫分離的特點(diǎn)，給該病的及時(shí)檢測(cè)帶來(lái)了很大困難，前期研究發(fā)現(xiàn)該病在感染前期以細(xì)胞免疫為主并伴隨著間歇排菌，經(jīng)過(guò)2到5年亞臨床期后體液免疫應(yīng)答增強(qiáng)，同時(shí)排菌量明顯增加，針對(duì)感染后的不同時(shí)期，幾種檢測(cè)方法的敏感性與特異性存在較大的差異，加之副結(jié)核分枝桿菌與牛結(jié)核分枝桿菌以及其他環(huán)境分枝桿菌存在高度同源性，給牛副結(jié)核病診斷帶來(lái)了很大的困難。所以，建立理想的牛副結(jié)核病檢測(cè)方法有利于及早發(fā)現(xiàn)感染牛并及時(shí)淘汰出

3、群，對(duì)該病在牛場(chǎng)凈化具有很大的幫助?；谂８苯Y(jié)核病的免疫學(xué)規(guī)律，研究副結(jié)核病的診斷方法，以及不同診斷方法適用于副結(jié)核感染的不同時(shí)期具有重要意義。
　　本論文主要研究了牛副結(jié)核病原學(xué)檢測(cè)和體液免疫檢測(cè)方法，并對(duì)所建立的方法與常規(guī)變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行了比較，分析了各種方法檢測(cè)的特點(diǎn)。
　　病原學(xué)檢測(cè)方法研究中，本研究將草分枝桿菌用甘油瓊脂復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)接到甘油肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，采用蒸餾法，結(jié)合石油醚反復(fù)抽提，成功制備了草分枝菌素。將草分

4、枝菌素按1％加入潘氏培養(yǎng)基中，成功制備適合副結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。用副結(jié)核分枝桿菌參考株P(guān)18對(duì)制備的培養(yǎng)基進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，本研究制備的副結(jié)核培養(yǎng)基對(duì)副結(jié)核分枝桿菌具有良好的培養(yǎng)能力。根據(jù)副結(jié)核特異性插入序列IS900，設(shè)計(jì)引物一對(duì)特異性引物（IS900 F和IS900 R），建立了能夠檢測(cè)副結(jié)核分枝桿菌的特異性PCR方法，并用4株副結(jié)核分枝桿菌，以及牛結(jié)核分枝桿菌、草分枝桿菌、禽結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)了該

5、方法良好的敏感性和特異性。使用建立的PCR檢測(cè)方法，對(duì)山東地區(qū)采集的300份糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中有38份為陽(yáng)性。
　　血清學(xué)檢測(cè)方法研究中，我們采用大腸桿菌原核系統(tǒng)，克隆表達(dá)了5個(gè)副結(jié)核特異性蛋白MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963，將表達(dá)產(chǎn)物純化并定量后，初步建立針對(duì)各蛋白抗體的ELISA檢測(cè)方法，并用臨床樣本對(duì)5個(gè)重組蛋白在血清學(xué)診斷中的作用進(jìn)行研究，結(jié)果MAP0862與MAP134

6、5具有較好的診斷價(jià)值，對(duì)300份臨床血清的檢測(cè)結(jié)果表明，兩者與IDEXX牛副結(jié)核檢測(cè)試劑盒的符合率分別為94.3%與93.7%。同時(shí)還將具有良好抗原性的兩個(gè)基因MAP0862與MAP1345進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，并探索串聯(lián)表達(dá)蛋白在血清學(xué)診斷中的作用,結(jié)果串聯(lián)表達(dá)的MAP0862-1345與兩個(gè)蛋白在單獨(dú)存在的情況下診斷效果類似，其與IDEXX副結(jié)核檢測(cè)試劑盒的總符合率為92.7%。使用初步建立的基于不同副結(jié)核特異性蛋白的間接ELISA方法對(duì)實(shí)

7、驗(yàn)室保存的人工感染副結(jié)核后不同時(shí)期的牛血清進(jìn)行檢測(cè)，研究感染后不同時(shí)期血清中針對(duì)幾種特異性蛋白的抗體變化規(guī)律。通過(guò)對(duì)特異性表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)分析，選擇各蛋白強(qiáng)抗原表位進(jìn)行了化學(xué)合成，探索合成多肽在血清學(xué)診斷中的作用,結(jié)果基于MAP0862的2#多肽與基于MAP1345的3#多肽具有良好的診斷價(jià)值。
　　對(duì)山東某牛場(chǎng)300頭青年牛分別用本研究所建立的PCR方法和針對(duì)特異性蛋白的ELISA方法，以及經(jīng)典的皮膚變態(tài)反應(yīng)，商品化ELISA方法