毛開榮牛結(jié)核病防控北京

1、牛結(jié)核病防控進展,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 毛開榮13621394758Email:maokairong@ivdc.gov.cn,牛結(jié)核病,,人型菌,牛型菌,人,犬,貓,牛,馬,羊,豬,雞,,,,,,,,,,,,,,,病原-致病性結(jié)核分枝桿菌屬,人型菌 & 牛型菌基因水平上99.95%同源感染譜相互交叉10%結(jié)核病人感染牛型菌人型菌可感染牛,(Chen, 2009),,,,,,,,結(jié)核病防治的新挑戰(zhàn)？人 -牛,除非

2、撲滅牛結(jié)核病，否則人類結(jié)核病的控制是不會成功的。 ——世界衛(wèi)生組織第七次專家委員會報告,牛結(jié)核是可以控制的,美國1917年開始根除計劃，用約50年宣布根除牛的牛結(jié)核，但野生動物依然存在感染英國每年約花費7000多萬英鎊控制牛結(jié)核澳大利亞1970至1997年歷時27年根除牛結(jié)核控制牛結(jié)核需要科學的方法加長期的規(guī)劃根除牛結(jié)核則需國家大量的投入,1. 流行病學,傳染原：開放性結(jié)核病牛是主要的傳染源 引起牛結(jié)核病原

3、牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌。引起（人）結(jié)核病原結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核桿菌其他動物結(jié)核病原靈長類與人相似其他哺乳動物與牛相似、禽類以禽型結(jié)核桿菌為主,《伯杰細菌學鑒定手冊》,分枝桿菌屬為2 大類: 緩慢生長分枝桿菌快速生長分枝桿菌（通常不致?。?快速生長分枝桿菌（ NTM ）,目前發(fā)現(xiàn)NTM有150多種，僅20余種致病。代表性菌種為日內(nèi)瓦分枝桿菌致HIV／AIDS發(fā)生播散型NTM病，并迅速致死。I群一光產(chǎn)色分枝桿菌代表

4、性菌種有：堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、猿猴分枝桿菌。Ⅱ群一暗產(chǎn)色分枝桿菌代表性菌種有：瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、蘇加分枝桿菌。Ⅲ群一不產(chǎn)色分枝桿菌代表性菌種有鳥一胞內(nèi)復合體分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、土地分枝桿菌、嗜血分枝桿菌。Ⅳ群—快速生長分枝桿菌代表性菌種有：偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌。,緩慢生長分枝桿菌,結(jié)核分枝桿菌復合物(或群) 結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌非洲分枝桿菌田鼠分

5、枝桿菌麻風分枝桿菌 禽結(jié)核分枝桿菌副結(jié)核分枝桿菌……,宿主,牛分枝桿菌主要引起牛結(jié)核病。也引起人類結(jié)核病。有5%～ 10% 以上的人結(jié)核是由牛分枝桿菌引起。還可感染牛、豬、人、鹿和大象等50 種溫血脊椎動物。 20 多種禽類。結(jié)核分枝桿菌主要引起人類結(jié)核病, 參考菌株為H37Rv;田鼠分枝桿菌引起鼠類結(jié)核病; 非洲分枝桿菌引起人類結(jié)核病。,主要感染途徑為呼吸道和消化道。相對來說，成年牛易經(jīng)呼吸道感染，而青年牛

6、易經(jīng)消化道感染。呼吸道感染主要由帶菌塵?；驓馊苣z所造成。消化道感染則常因飼草、飼料被污染。犢牛感染主要是吮吸帶菌的乳汁造成的。此外，也可通過交配感染。,傳染途徑,易感動物,牛人、豬、鹿和大象等50 種溫血脊椎動物。20 多種禽類。,影響因素,飼養(yǎng)管理不良，使役過度，與牛結(jié)核病的傳染有密切關系。特別是牛舍過于擁擠，通風不良，潮濕，光線不好，是造成本病擴散的重要因素。飼料配比不當、飼料中缺乏維生素和礦物質(zhì)等，均可促進本病的發(fā)

7、生。,牛結(jié)核的分布,廣泛流行于世界各地尤以奶牛業(yè)發(fā)達國家為嚴重。地區(qū)流行或散發(fā)流行,2012年全球牛結(jié)核分布,,診斷,1. 流行病學2. 癥狀 3. 病理變化4. 檢測病原免疫學試驗,結(jié)核病檢測,膠體金,γ-干擾素,ELISA,PPD皮試,免疫學診斷,分子生物學,體液免疫,細菌學診斷,,,,,,細胞免疫,,,,,2.癥狀,,,消瘦,臨床癥狀只能提示但不能確定該病。牛型結(jié)核分枝桿菌感染初期或輕度感染時，可能不出現(xiàn)

8、臨床癥狀。通常呈慢性經(jīng)過，病初癥狀不明顯，患病較久，由于患病器官不同，癥狀亦不一致。,癥狀,潛伏期,活動期,16-45d長者達數(shù)月，甚至數(shù)年、終生,無明顯癥狀不發(fā)病,肺結(jié)核,肺外結(jié)核,,,咳嗽病牛常發(fā)肺結(jié)核，易疲勞，常有短而干的咳嗽，尤其當起立、運動、吸入冷空氣或塵埃時隨后咳嗽加重，頻繁且表現(xiàn)痛苦。呼吸次數(shù)增多或發(fā)生氣喘。消瘦消瘦，貧血，有的牛肩前、股前、腹股溝、頜下、咽及頸淋巴結(jié)等體表淋巴結(jié)腫大。當縱膈淋巴結(jié)受侵害腫大，

9、壓迫食道，則有慢性脹氣癥狀。病勢惡化，可能發(fā)生全身性結(jié)核，即粟粒性結(jié)核。胸膜、腹膜發(fā)生結(jié)核病灶時呈現(xiàn)所謂的“珍珠病”，胸部聽診可聽到摩擦音。,乳房感染多數(shù)病牛乳房常被感染侵害，可見乳房上淋巴結(jié)腫大無熱無痛，泌乳量減少，乳汁初期無變化，病重時呈水樣稀薄。頑固性下痢腸道結(jié)核多見于犢牛，可表現(xiàn)為消化不良，食欲不振，頑固性下痢，迅速消瘦。,性機能紊亂生殖器官結(jié)核可出現(xiàn)性機能紊亂，發(fā)情頻繁且表現(xiàn)性欲亢進，慕雄狂與不孕。孕畜流產(chǎn)，公畜副睪及

10、睪丸腫大，陰莖前部可發(fā)生結(jié)節(jié)、糜爛等。神經(jīng)癥狀中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要是腦及腦膜發(fā)生結(jié)核病變，常引起神經(jīng)癥狀，如癲癇樣發(fā)作、運動障礙等。,禽型結(jié)核分枝桿菌感染可能無臨床癥狀，但亦可能出現(xiàn)昏睡和消瘦。在應激條件下，可能發(fā)生突然死亡，這往往與嚴重的肝臟病變有關，象這樣的病變在死后解剖時容易觀察到。禽型結(jié)核分枝桿菌能引起人的一種漸進性的難以治療的疾病。因此所有操作均須在有充分生物防護裝置的條件下進行。,人型結(jié)核分枝桿菌感染除靈長類動物會出現(xiàn)

11、咳嗽等癥狀外，其他動物一般無明顯臨床癥狀。,3. 病理變化,牛型結(jié)核分枝桿菌感染病變可發(fā)生在所有內(nèi)臟器管最常見的是肺、胸膜、腸系膜淋巴結(jié)。感染早期，可在肺門部位及肺門淋巴結(jié)見到干酪樣壞死或鈣化的病灶。感染中后期，可在胸膜、胸腔見到“珍珠狀”增生，形成所謂的“珍珠胸”。在腸系膜可見到串珠狀淋巴結(jié)腫大。,分枝桿菌培養(yǎng)鑒定,實驗流程1、染色鏡檢確定是否是抗酸菌的培養(yǎng)陽性菌株2、確定該菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復合群還是NTM首

12、先經(jīng)對硝基苯甲酸 (PNB)生長試驗、28℃生長試驗、耐熱觸酶試驗、觀察記錄細菌的生長速度、菌落形態(tài)和菌落顏色確定該菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復合群還是NTM。3、確定該菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復合群什么型進行TCH生長試驗、硝酸還原試驗和煙酸試驗進行菌種鑒定。,結(jié)核菌素反應與病變,牛結(jié)核菌素陽性反應，但剖檢時找不到病變。當牛結(jié)核病在牛群中嚴重流行時，遇到這種情況不多。但對于牛結(jié)核病清凈的牛群，這種情況就比較常見了。無

13、病變的牛結(jié)核菌素陽性反應是不是完全屬于非特異性反應？這種情況很難作出明確診斷，因為有些牛雖然感染牛型結(jié)核分枝桿菌，但病變很少或不明顯，解剖時不易發(fā)現(xiàn)，有的感染牛沒有任何病變。,病原分離及鑒定,病料淋巴結(jié)痰乳精液子宮分泌物尿和糞便,病原檢測,染色鏡檢培養(yǎng)特性動物試驗生化試驗分子生物學診斷,染色鏡檢,涂片先在玻片上涂布一層薄甘油蛋白，甘油蛋白的配制：雞蛋白20mL，甘油20mL，水楊酸鈉0.4g，混勻。如檢驗標本

14、為乳汁等含脂肪較多的材料，在涂片制成后，用二甲苯或乙醚脫脂1－2分鐘后傾去，再滴加95％酒精以除去二甲苯，待酒精揮發(fā)后即可染色。然后吸取標本滴加其上，涂布均勻。,萋－尼氏抗酸染色,涂片后，經(jīng)火焰固定加石炭酸復紅染色液用100mL 95％酒精加3g堿性復紅配制成堿性復紅飽和酒精溶液，取堿性復紅飽和酒精溶液10mL，與5％苯酚溶液90mL混合后用濾紙濾過將玻片在火焰上加熱至出現(xiàn)蒸汽（不能產(chǎn)生氣泡），如此熱染5分鐘（如染色液干涸，須加

15、適量補充）。水洗后滴加3％鹽酸酒精脫色30－60秒（至無色素脫下為止）濃鹽酸3mL，95％酒精97mL，混勻。水洗后，以駱氏美蘭染色液復染1分鐘。甲液：美蘭0.3g，95％酒精30mL。乙液：0.01％氫氧化鉀溶液100mL?；旌霞闯伤?，吸干，鏡檢?？顾峋鷳槐畸}酸酒精脫色而染成紅色，其他細菌與動物細胞可被鹽酸酒精脫色而均被染成蘭色。,菌體形態(tài),牛結(jié)核分枝桿菌呈細長平直或微彎曲的桿菌，長1.5-5微米，寬0.2-0.5微米

16、.在陳舊培養(yǎng)基上或干酪性淋巴結(jié)內(nèi)的菌體，偶而可見長達10微米或更長,培養(yǎng),將經(jīng)過處理的被檢樣品標本接種到培養(yǎng)基上（同時作2－4份）培養(yǎng)一天后，以熔化的石蠟封口，繼續(xù)培養(yǎng)。 牛型結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，初次分離培養(yǎng)時，需36－37℃培養(yǎng)5－8周方可出現(xiàn)菌落。在固體培養(yǎng)基上不產(chǎn)生任何顏色，菌落濕潤、略顯粗糙并發(fā)脆。加1％的丙酮酸鈉能促進生長。若是非典型分枝桿菌，則生長較快，大部分（但不是全部）產(chǎn)生白色或具有橙色或黃色色素，常

17、形成黃色或橙色菌落。某些種類的色素只有在亮處才顯出。,BACTEC培養(yǎng)法,利用放射性測定技術(shù)與培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的一種技術(shù)。BACTEC培養(yǎng)法商品盒試劑。本方法的優(yōu)點是：比標準培養(yǎng)法檢測到的菌量更低，培養(yǎng)時間更短（只需2～8周左右）。本法的缺點是：費用高，需專用儀器，需防止放射性污染。,用動物分離,豚鼠和家兔對牛型結(jié)核分枝桿菌敏感，雞對牛型結(jié)核分枝桿菌不敏感。處理過的病料，皮下或肌肉、腹腔內(nèi)注射接種后30天左右，進行禽型提純結(jié)核菌

18、素和牛型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗如有陽性反應，可剖檢其中的半數(shù)動物進行病理學觀察、細菌培養(yǎng)和涂片鏡檢。另一半繼續(xù)觀察至3個月再剖檢觀察。如果為陰性反應，可于40天左右剖檢其中的半數(shù)，觀察病理學變化、細菌培養(yǎng)和涂片鏡檢，另一半繼續(xù)觀察至3個月再剖檢觀察。,牛型、禽型和人型結(jié)核分枝桿菌鑒定,動物試驗,牛型、禽型和人型結(jié)核分枝桿菌鑒定,生化試驗：,分子生物學診斷,DNA針擴增從臨床樣品提取的靶序列，是來自熱休克基因，大小為402堿基

19、對(bp)片段，336bp和123bp為重復片段，或者單獨插入對結(jié)核分枝桿菌特異的IS986、ISl081序列。PCR報道PCR能區(qū)別結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。在實際應用中，需要進一步評價其特異性，特別是敏感性。擴增片段可以看得見，可用生物素或地高辛代替同位素進行標記。,免疫學試驗,結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗全血試驗 淋巴細胞增生試驗、Υ－干擾素試驗 血清學試驗ELISA、膠體金,結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗,用結(jié)核菌素進行的皮

20、內(nèi)變態(tài)反應試驗是檢查牛結(jié)核病主要方法。亦是OIE指定國際貿(mào)易用檢測試驗。試驗分2種，一種是牛型結(jié)核菌素單一試驗，僅用牛型提純結(jié)核菌素進行，目的是檢測是否存在牛型結(jié)核分枝桿菌的感染。另一種是結(jié)核菌素比較試驗，用牛型提純結(jié)核菌素和禽型提純結(jié)核菌素同時進行，這是一種鑒別診斷試驗，用以明確是牛型結(jié)核分枝桿菌感染，還是禽型或副結(jié)核分枝桿菌或其他分枝桿菌感染。,PPD皮試操作流程,皮試工具,判定標準,結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應的特點,世界動物衛(wèi)生組織OI

21、E迄今為止唯一推薦的牛結(jié)核病的診斷方法非特異性反應重癥牛敏感性低操作復雜煩瑣結(jié)果判斷主觀性大,皮內(nèi)變態(tài)反應比較試驗,本試驗采用牛型提純結(jié)核菌素和禽型提純結(jié)核菌素同時進行。操作方法：在牛頸中部選2個點，一個在上1/3處一個在下1/3處。2個點之間的距離不得少于10cm。注射點及周圍的皮膚應無異常。禽型提純結(jié)核菌素的注射劑量為每頭0.1ml，含0.25萬IU。即將禽型提純結(jié)核菌素稀釋成每毫升含2.5萬IU后，皮內(nèi)注射0.1毫升

22、。牛型提純結(jié)核菌素的注射劑量為每頭0.1ml，含0.20～0.5萬IU。即將牛型提純結(jié)核菌素稀釋成每毫升含2.0～5.0萬IU后，皮內(nèi)注射0.1毫升。,結(jié)果判定a)牛型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗陽性。對牛型提純結(jié)核菌素的反應為陽性（局部有明顯的炎性反應，皮厚差大于或等于4.0 mm），并且對牛型提純結(jié)核菌素的反應大于對禽型提純結(jié)核菌素的反應，二者皮差在2.0 mm以上，判為陽性。對已經(jīng)定性為牛型結(jié)核分枝桿菌感染的牛群。其中即使

23、少數(shù)牛的皮差在2.0 mm以下，甚至對牛型提純結(jié)核菌素的反應略小于對禽型提純結(jié)核菌素的反應（反應差小于或等于2.0 mm），只要對牛型提純結(jié)核菌素的反應在2.0 mm以上，也應判定為牛型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗陽性牛。,b)禽型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗陽性。 對禽型提純結(jié)核菌素的反應大于對牛型提純結(jié)核菌素的反應，兩者的皮差在2.0 mm以上，判為禽型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗陽性。對已經(jīng)定性為副結(jié)核分枝桿菌或禽型結(jié)核分枝桿

24、菌感染的牛群。其中即使少數(shù)牛的皮差在2.0 mm以下，甚至對禽型提純結(jié)核菌素的反應略小于對牛型提純結(jié)核菌素的反應（不超過2.0 mm），只要對禽型提純結(jié)核菌素的反應在2.0 mm以上，也應判為禽型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗陽性牛。,全血試驗,除了傳統(tǒng)的結(jié)核菌素試驗方法外，現(xiàn)有了一些新的血液診斷試驗方法。淋巴細胞增生試驗原理測定全血樣品中致敏淋巴細胞對結(jié)核菌素PPD抗原的細胞反應性。這種試驗具有科學價值，但在常規(guī)診斷中并不采用，

25、因為試驗耗時，而且前期準備以及試驗操作都比較復雜(需要較長的孵育期，并使用放射性核甙酸)。然而，這種試驗可用于野生動物以及動物園動物的檢測．,r干擾素試驗本試驗是測定全血培養(yǎng)系統(tǒng)中淋巴因子的釋放原理有特異性抗原(PPD--結(jié)核菌素)培育16—24小時培育期間內(nèi)，致敏淋巴細胞釋放出r干擾素。用對牛r干擾素的兩種MAb，作夾心ELISA法。 單抗1 單抗1+干擾素 單抗1+干擾素+單

26、抗2,,,,,,,,,,,,,,,IFN-?檢測方法,IFN-?釋放檢測特點,高特異性，高敏感性 外周血，24h出結(jié)果 比TST更貴，采血后在12小時內(nèi)檢測 Bovi?TB IFN-gamma kit 目前發(fā)達國家均以該方法輔助進行結(jié)核病根除計劃樣品不能存放，在8小時內(nèi)進行。此外，這種方法僅適用于?？苿游铩?尾靜脈采血,方便快速 一般不需要保定減小應激,尾靜脈采血方法,牛尾靜脈位于尾椎腹側(cè)正中的脈管溝內(nèi)左手抓住

27、尾巴垂直上舉,右手用鑷子取5%碘酒棉球在尾根1 /2～1 /3處(離尾根處7-15cm)進行消毒手持9號采血器,順血管斜角刺入,見有血液回流,即可外拉針芯使血液流入采血器采血完畢,局部消毒適當按壓,結(jié)核菌的細胞免疫與體液免疫規(guī)律,90%結(jié)核菌感染者不發(fā)病細胞免疫和體液免疫分離早期發(fā)生細胞免疫病程后期體液免疫增加,牛結(jié)核病特異抗體檢測方法,ELISA方法膠體金方法Rv3872CFP10ESAT6MPB70MPB83

28、,牛結(jié)核特異抗體檢測,檢測針對特異抗原（單個或多個）的抗體抗體消長規(guī)律復雜！總體而言抗體水平與病程發(fā)展成正比抗體針對的抗原，抗體類型，抗體水平因個體而異，因時而異方法敏感性低多抗原聯(lián)合使用及與TST聯(lián)合使用可顯著提高檢出率,防制,5個方面 1.監(jiān)測2.檢疫3.公共衛(wèi)生4.封閉與消毒5.規(guī)范管理,1.監(jiān)測一年2次變態(tài)反應?；蛘?次r干擾素試驗。2.檢疫出入動物必須檢疫，隔離2個月左右， 2次變態(tài)反應。3.公共衛(wèi)