結(jié)核菌特異性γ干擾素測(cè)定方法的建立及其在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用.pdf

1、[目的]
　　 1、建立適合中國(guó)人群使用的結(jié)核分枝桿菌特異性IFN-γELISPOT(簡(jiǎn)稱Elispot)檢測(cè)方法。
　　 2、采用建立的Elispot技術(shù)對(duì)不同人群檢測(cè)，通過與現(xiàn)有的結(jié)核病診斷技術(shù)進(jìn)行比較，確定Elispot檢測(cè)的閾值，評(píng)價(jià)Elispot技術(shù)以該閾值為判斷標(biāo)準(zhǔn)的在結(jié)核病診斷的敏感性和特異性。
　　 3、監(jiān)測(cè)抗結(jié)核過程中IFN-γ應(yīng)答水平變化情況，評(píng)價(jià)IFN-γ在監(jiān)測(cè)抗結(jié)核療效中的作用。
　

2、　 [方法]
　　 1、采用重組早期分泌抗原靶6kDa蛋白(ESAT-6)以及以ESAT-6和培養(yǎng)過濾蛋白(CFP-10)來源的多肽庫(kù)為抗原，建立結(jié)核分枝桿菌特異性IFN-γ ELISPOT檢測(cè)技術(shù)(簡(jiǎn)稱Elispot)；
　　 2、應(yīng)用該技術(shù)對(duì)221例肺結(jié)核病患者、79例肺外結(jié)核患者、347例健康對(duì)照者、90例結(jié)核患者健康接觸者和18例肺部疾病對(duì)照的外周血結(jié)核菌特異性IFN-γ水平進(jìn)行檢測(cè)；
　　 3、對(duì)其中

3、部分志愿者同時(shí)采用QFT-G-IT和/或T-SPOT.TB進(jìn)行特異性IFN-γ測(cè)定、結(jié)核抗體檢測(cè)以及PPD皮試；
　　 4、對(duì)部分進(jìn)行抗結(jié)核治療的結(jié)核患者進(jìn)行定期隨訪。
　　 [結(jié)果]
　　 1.建立了適合中國(guó)人群使用的結(jié)核分枝桿菌特異性IFN-γ ELISPOT檢測(cè)方法
　　 (1)確定了Elispot檢測(cè)主要參數(shù)，并此基礎(chǔ)上篩選ESAT-6蛋白、P4-6多肽、P8.10多肽為主要抗原并優(yōu)化Elispo

4、t檢測(cè)程序。
　　 (2)通過對(duì)PPD陰性健康者與痰菌陽(yáng)性的結(jié)核病人Elispot檢測(cè)結(jié)果繪制各刺激物ROC曲線，確定劃分結(jié)核感染者與健康者的ESAT-6蛋白、P4-6多肽和P8.10多肽特異性IFN-γ反應(yīng)閾值分別為30、10、20個(gè)斑點(diǎn)/2×105個(gè)細(xì)胞。
　　 2.對(duì)結(jié)核菌特異性IFN-γ ELISPOT技術(shù)的特異性和敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)
　　 (1)采用上述確定的Elispot閾值為反應(yīng)陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，不同組別人

5、群IFN-γ反應(yīng)陽(yáng)性率分別為：89痰涂陽(yáng)性肺結(jié)核組中80例陽(yáng)性(89.89％)、132例痰涂陰性肺結(jié)核中107例陽(yáng)性(81.06％)，79肺外結(jié)核組中66例陽(yáng)性(83.54％)、350例健康組中40例為陽(yáng)性(13.71％)，18例肺疾病組中2例為陽(yáng)性(11.11％)。肺結(jié)核組陽(yáng)性率分別與健康組和肺疾病組反應(yīng)陽(yáng)性率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.05)，與肺外結(jié)核組反應(yīng)陽(yáng)性率比較兩者差異無(wú)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　

6、　 (2)對(duì)其中153例受試者同時(shí)采用Elispot檢測(cè)和QFT-G-IT檢測(cè)，配對(duì)比較兩組反應(yīng)結(jié)果，兩種方法檢測(cè)結(jié)果基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=0.1176，P=0.7316)。分別配對(duì)比較健康組和結(jié)核病人組兩種檢測(cè)方法的結(jié)果，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。
　　 (3)對(duì)其中10例健康者和12例結(jié)核病人同時(shí)采用Elispot檢測(cè)和T-SPOT.TB檢測(cè)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=0.

7、5，P=0.4795)。
　　 (4)對(duì)113例結(jié)核患者和90例健康者同時(shí)采用Elispot檢測(cè)和結(jié)核抗體檢測(cè)。在結(jié)核患者中Elispot陽(yáng)性率(77.88％)高于抗體檢測(cè)法(60.18％)，在健康者中Elispot檢測(cè)陽(yáng)性率(14.56％)明顯低于抗體檢測(cè)法陽(yáng)性率(26.67％)。對(duì)兩種檢測(cè)方法在結(jié)核中的診斷價(jià)值評(píng)價(jià)，Elispot陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(86.27％)與陰性預(yù)測(cè)值(75.25％)分別與抗體檢測(cè)法比較(73.91％和59.

8、46％)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=3.9407，P=0.0471；X2=5.2676，P=0.0217)。
　　 (5)采用Elispot對(duì)90例不同暴露程度級(jí)別的結(jié)核接觸者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其IFN-γ的應(yīng)答陽(yáng)性率情況為：4級(jí)55.6％、3級(jí)37.5％、2級(jí)11.1％、1級(jí)7.9%。Elispot檢測(cè)陽(yáng)性率與結(jié)核菌暴露程度成正相關(guān)(r=0.4155，P<0.0001)；IFN-γ分泌水平與結(jié)核暴露程度成正相關(guān)(r=0.451

9、8，P<0.001)。PPD皮試陽(yáng)性率與暴露程度無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.1206，P=0.2073)。
　　 3.監(jiān)測(cè)抗結(jié)核過程中IFN-γ應(yīng)答水平變化情況，評(píng)價(jià)IFN-γ在監(jiān)測(cè)抗結(jié)核療效中的作用。
　　 對(duì)13例結(jié)核病人分別在不同抗結(jié)核治療時(shí)間點(diǎn)(治療前、治療開始后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月)進(jìn)行隨訪，在不同時(shí)間點(diǎn)IFN-γ的反應(yīng)水平有波動(dòng)，在抗結(jié)核治療6個(gè)月時(shí)IFN-γ有下降的趨勢(shì)。
　　 [結(jié)論]
　　

10、1.成功建立了結(jié)核菌特異性IFN-γ Elispot檢測(cè)技術(shù)，初步確定陽(yáng)性判斷的閾值。
　　 2.Elispot檢測(cè)在結(jié)核病診斷的特異性與敏感性與兩種同類進(jìn)口試劑盒進(jìn)行基本一致；而顯著優(yōu)于結(jié)核抗體檢測(cè)和PPD皮試。
　　 3.通過對(duì)接受抗結(jié)核治療病人隨訪發(fā)現(xiàn)，IFN-γ反應(yīng)水平隨抗結(jié)核治療時(shí)間而下降，對(duì)結(jié)核治療判斷的效果有一定的參考意義。
　　 4.綜上所述，Elispot檢測(cè)在診斷結(jié)核菌感染的初步應(yīng)用顯示出較好