結(jié)核特異性抗體結(jié)合肽的篩選及其在結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：利用純化的結(jié)核病人血清IgG從噬菌體展示隨機(jī)7肽庫(kù)中篩選結(jié)核特異性抗體結(jié)合肽，為下一步開(kāi)發(fā)新的結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)方法提供思路。
　　 方法：篩選策略一以12份結(jié)核病人混合純化后的血清IgG作為固相配基，按吸附、洗脫、擴(kuò)增的生物淘洗(簡(jiǎn)稱淘選)過(guò)程對(duì)噬菌體展示隨機(jī)7肽庫(kù)進(jìn)行篩選，并于第2至3輪的篩選中加入12份健康人血清混合純化后的IgG進(jìn)行反篩，經(jīng)過(guò)3輪淘選使噬菌體得到富集，從滴度測(cè)定平板上各個(gè)方位挑取結(jié)核病人IgG和健康人

2、IgG單噬菌體各20個(gè)進(jìn)行擴(kuò)增純化，提取單鏈DNA進(jìn)行測(cè)序，間接ELISA法檢測(cè)不同單噬菌體與結(jié)核病人和健康人IgG的結(jié)合情況，鑒定出陽(yáng)性克隆。篩選策略二四輪均先以上述健康人血清IgG進(jìn)行反篩，再以上述結(jié)核病人血清IgG篩選，鑒定出陽(yáng)性克隆。取收集的47份結(jié)核病人和37份有卡介苗接種史的健康人血清標(biāo)本，采用phage-ELISA法對(duì)獲得的陽(yáng)性單噬菌體進(jìn)行初步驗(yàn)證，并統(tǒng)計(jì)其中24份篩選用血清標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性多肽體外合成后，建立間接EL

3、ISA檢測(cè)方法，完成147份結(jié)核病人血清、對(duì)照血清(含22份非結(jié)核病人血清和135份健康人血清)的檢測(cè)。
　　 結(jié)果：通過(guò)淘選，能與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體得到明顯富集。單噬菌體測(cè)序分析共獲得20種共同序列。間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明單噬菌體H(12)、T6、T15和T18均與結(jié)核病人IgG具有較高的親和力(S/N≥2.1)，確定為陽(yáng)性克隆。其對(duì)47份結(jié)核病人和37份健康人血清標(biāo)本檢出值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)其中篩選用12份

4、結(jié)核病人和12份健康人血清標(biāo)本的檢出值同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？贵w結(jié)合肽H(12)、T15和T18，分別建立間接ELISA檢測(cè)方法，對(duì)147份結(jié)核病人血清、157份對(duì)照血清的檢測(cè)敏感性分別為59.9％，45.6％，59.2％；特異性分別為95.5％、96.2％和94.9％。
　　 結(jié)論：利用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)淘選獲得了結(jié)核特異性抗體結(jié)合肽，顯示出與結(jié)核病人IgG較特異的結(jié)合活性，為以多肽為基礎(chǔ)探索新的結(jié)核病血清學(xué)診斷方法提供了依據(jù)。