應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制Pin1基因表達(dá)對宮頸癌生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：蛋白質(zhì)分子在其脯氨酸前的絲/蘇氨酸模體（pSer/Thr-Pro motifs）的磷酸化是細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的主要信號調(diào)節(jié)機(jī)制。最近的研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子在其脯氨酸前的絲/蘇氨酸模體存在兩種截然不同的構(gòu)象，即順式和反式。這兩種構(gòu)象轉(zhuǎn)化速度，在磷酸化過程中被顯著的減慢，但卻可以被肽基脯氨酰同分異構(gòu)酶（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，Pin1）所特異性催化。這種由Pin1 所催化的構(gòu)象變化能

2、對許多磷酸化信號途徑產(chǎn)生影響，因此在不同的細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。 越來越多的研究證實(shí)Pin1在一些人類疾病的發(fā)病中起著重要角色，推測Pin1介導(dǎo)的磷酸化后調(diào)節(jié)可能為阻斷致癌途徑提供一個(gè)獨(dú)特的思路。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織是高表達(dá)的，因此，我們設(shè)想抑制宮頸癌中的Pin1的表達(dá)是否也可以阻斷腫瘤發(fā)生發(fā)展？本課題帶著這個(gè)問題，探討了干擾Pin1基因的表達(dá)是否在宮頸癌可以阻斷腫瘤的生物學(xué)行為，阻遏腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為宮頸癌的臨

3、床治療提供有價(jià)值的補(bǔ)充。 研究方法： 一、體外水平，選取宮頸癌SiHa細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為三組SiHa/Pin1-si轉(zhuǎn)染組，SiHa/Con-si空載體對照組和SiHa空白對照組： 1. 構(gòu)建Pin1小干擾RNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞并采用RT-PCR和westernblot技術(shù)檢測Pin1基因的干擾效果； 2. MTT 法檢測轉(zhuǎn)染了Pin1小干擾RNA質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞增殖活性的改變以及對化療藥物順鉑

4、的敏感性； 3. TUNEL、Hoechst33258 染色法和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡改變； 4. MTT 比色法檢測細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力； 5. Transwell 侵襲小室測定法檢測細(xì)胞侵襲能力的改變； 6. 體外遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化； 7. Western blot檢測VEGF和MMP-2的表達(dá)的變化； 8. 明膠酶譜法檢測MMP-2的活性改變。 二、在體水

5、平，選取4-6周齡的雌性BALB/C裸小鼠成功構(gòu)建宮頸癌SiHa細(xì)胞的裸鼠移植瘤模型后，設(shè)Pin1-siRNA 治療組，Con-siRNA和PBS 治療組： 1. 觀察裸鼠移植瘤的生長情況，每周檢測體積2-3 次，比較移植瘤的體積和重量； 2. Western blot檢測瘤體內(nèi)MMP-2和VEGF的蛋白表達(dá)水平； 3. 免疫組化檢測瘤體以及肺、腎、心臟組織中的MMP-2和VEGF的蛋白表達(dá)強(qiáng)弱。 結(jié)果：