青藤堿對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞凋亡和P-ERK1-2及IL-2表達(dá)影響的體外研究.pdf

1、目的:研究青藤堿(Alkaloid sinomenine,SIN)對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞凋亡和P-ERK1/2及IL-2表達(dá)的體外影響,探討SIN對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞免疫抑制作用的效應(yīng)和分子生物學(xué)機(jī)制,為臨床應(yīng)用SIN進(jìn)行器官移植免疫治療的提供理論依據(jù)。
　　方法:在衡陽(yáng)市中心血站抽取三個(gè)健康人肘靜脈血50ml,肝素(10U/ml)抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液從血液標(biāo)本中分離PBMC,并制成PBMC懸液。通過(guò)免疫磁珠分離法從PBM

2、C懸液中分選CD4+T細(xì)胞。將CD4+T細(xì)胞用10％FCS RPMI-1640完全培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。CD4+T細(xì)胞經(jīng)終濃度為5ug/ml的PHA和終濃度為100U/ml的IL-2擴(kuò)增7天后,將擴(kuò)增后的的細(xì)胞用PBS洗3遍,各組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為1ug/ml的抗CD3單克隆抗體,繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后,各均分為6組細(xì)胞培養(yǎng)并作以下處理:(1)、I組(空白對(duì)照組):細(xì)胞培養(yǎng)液中不加入任何藥物;(2)、II組(CsA組):

3、細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為50ng/ml的CsA溶液;(3)、III組(低濃度 SIN組):細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10umol/L的SIN溶液;(4)、IV組(中濃度SIN組):細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為200umol/L的SIN溶液;(5)、V組(高濃度SIN組):細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為1000umol/L的SIN溶液;(6)、VI組(CsA+中濃度SIN組):細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為50ng/ml的CsA溶液和終濃度為200umol

4、/L的SIN溶液。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后,對(duì)各份細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè):1)、流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;2)、Western blot法檢測(cè)P-ERK1/2蛋白表達(dá);3) ELLSA法檢測(cè)IL—2表達(dá)。
　　結(jié)果:1、FCM檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞亞二倍體表達(dá)率(%):1)對(duì)照組:1.70±0.30;2) CsA組:1.70±0.15;3)低濃度SIN組:1.83±0.15;4)中濃度SIN組:6.9±0.30;5)高濃度SIN組:10

5、.17±0.32;(6)CsA+中濃度SIN組:6.67±0.40。從結(jié)果可以看出:低濃度SIN組、中濃度SIN組、高濃度SIN組CD4+T淋巴細(xì)胞亞二倍體表達(dá)率依次增高,中濃度組、高濃度SIN組及CsA+中濃度SIN組與對(duì)照組及低濃度SIN組、CsA組存在顯著性差異(p<0.05)。2、Western blot法檢測(cè)P-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平(灰度值):1)對(duì)照組:3.15±0.06;2) CsA組3.15±0.05;3)低濃度S

6、IN組:3.09±0.04;4)中濃度SIN組:0.93±0.03;5)高濃度SIN組:0.64±0.03;6)CsA+中濃度SIN組0.93±0.02。從結(jié)果可以看出:低濃度SIN組、中濃度SIN組、高濃度SIN組CD4+T淋巴細(xì)胞亞二倍體表達(dá)率依次降低,中濃度組、高濃度SIN組及CsA+中濃度SIN組與對(duì)照組及低濃度SIN組、CsA組存在顯著性差異(p<0.05)。3、ELLSA法檢測(cè)IL—2表達(dá)水平:1)對(duì)照組:10.17±0.4

7、2;2) CsA組:5.26±0.39;3)低濃度SIN組:10.30±0.46;4)中濃度SIN組:8.9±0.20;5)高濃度SIN組:6.47±0.31;6)CsA+中濃度SIN組4.37±0.38。從結(jié)果可以看出:低濃度SIN組與對(duì)照組無(wú)顯著差異外(p>0.05),其它各組組間IL-2表達(dá)水平均數(shù)兩兩比較均有顯著性差異(p<0.05)4、結(jié)果提示:1)SIN能誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡,作用與濃度正相關(guān)(r=0.892)。2)

8、SIN誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡的過(guò)程中, P-ERK1/2信號(hào)被迅速抑制其作用與濃度相關(guān)(r=0.933).3)SIN能降低IL-2的表達(dá),作用與濃度相關(guān)(r=-0.949)且與CsA聯(lián)用有明顯協(xié)同作用。4)SIN與CsA聯(lián)用在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制P-ERK表達(dá)無(wú)明顯交互作用5)經(jīng)不同濃度的SIN處理后,人外周血CD4+T細(xì)胞凋亡率和P-ERK1/2的表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)(r=-0.833)
　　結(jié)語(yǔ):SIN能抑制IL-2的合成,且