三氧化二砷對急性哮喘小鼠CD4+T細胞凋亡的影響及機制研究.pdf

1、本文從以下三部分進行了論述。
　　第一章三氧化二砷對急性哮喘小鼠氣道高反應性及氣道炎癥的影響。
　　目的：
　　(1)建立急性哮喘小鼠模型，并鑒定建立的模型是否成功;
　　(2)觀察三氧化二砷對急性哮喘小鼠氣道高反應性及氣道炎癥的影響。
　　方法：
　　將30只SPF級BALB/c雌性小鼠隨機分為三組:正常組(PBS組)、哮喘組（OVA/PBS組）和三氧化二砷組（OVA/ATO組），每組10只。所有小

2、鼠適應性飼養(yǎng)一周后按以下方法建立急性哮喘小鼠模型。PBS組于第1、13天經(jīng)腹腔注射PBS緩沖液(PH7.2-7.4)0.2ml，第19-24天連續(xù)6天每天予以6ml PBS緩沖液(PH7.2-7.4)霧化30min，每次霧化前30min予以腹腔注射PBS緩沖液(PH7.2-7.4)0.2ml;OVA/PBS組于第1、13天經(jīng)腹腔注射OVA與氫氧化鋁凝膠的混合溶液(10μg OVA(GradeV)和2mg氫氧化鋁凝膠溶于PBS緩沖液中，充

3、分混勻）0.2ml，第19-24天連續(xù)6天每天予以5％OVA(GradeV)溶液6ml霧化30min，每次霧化前30min予以腹腔注射PBS緩沖液(PH7.2-7.4)0.2ml; OVA/ATO組于第1、13天腹腔注射OVA與氫氧化鋁凝膠的混合溶液(10μg OVA(GradeV)和2mg氫氧化鋁凝膠溶于PBS緩沖液中，充分混勻）0.2ml，第19-24天連續(xù)6天每天予以5％OVA(GradeV)溶液6ml霧化30min，每次霧化前3

4、0min予以腹腔注射三氧化二砷溶液（用量:2.5mg/kg×小鼠體重，配成0.2ml溶液）。第25天處理所有小鼠，檢測以下指標:(1)對小鼠的一般行為活動進行觀察;(2)不同濃度的乙酰甲膽堿激發(fā)小鼠后，采用有創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道反應性;(3)收集BALF行細胞計數(shù)及分類;(4)肺組織病理切片觀察炎癥細胞浸潤及黏液分泌情況。計量資料以均數(shù)±標準差((x)±S)表示。各組數(shù)據(jù)先行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則經(jīng)自然對

5、數(shù)轉換為正態(tài)分布的數(shù)據(jù)。若數(shù)據(jù)方差不齊，則行Dunnett's T3法。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(Analysisof Variance，ANOVA)，各組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　實驗前:各組小鼠的外觀、行為、對刺激的反應、活動及體重均無明顯差異。致敏階段:各組小鼠的腹腔注射部位無紅腫、潰爛。激發(fā)階段:PBS組小鼠飲食正常，活動靈敏，皮毛清潔有光澤，OVA/PBS

6、組小鼠早期出現(xiàn)興奮、打噴嚏、抓耳撓腮，后期出現(xiàn)匍匐不起、嗜睡癥狀，OVA/ATO組小鼠出現(xiàn)打噴嚏、興奮的癥狀較OVA/PBS組輕，無嗜睡癥狀。而且，實驗全程OVA/ATO組小鼠沒有活動減少、厭食、體重減輕等異常癥狀。
　　OVA/PBS組小鼠氣道反應性較PBS組顯著增高(P＜0.05);而OVA/ATO組小鼠氣道反應性較OVA/PBS組明顯降低(P＜0.05)。
　　OVA/PBS組小鼠BALF中白細胞總數(shù)為21.11±3.

7、28×104/ml、嗜酸性粒細胞數(shù)為3.10±0.50×104/ml、淋巴細胞數(shù)為6.60±0.97×104/ml、中性粒細胞數(shù)為4.92±0.45×104/ml，較PBS組均顯著增加（均P＜0.01）;OVA/ATO組BALF中自細胞總數(shù)為13.04±2.58×104/ml、嗜酸性粒細胞數(shù)為1.06±0.19×104/ml、淋巴細胞數(shù)為2.43±0.28×104/ml、中性粒細胞數(shù)為2.36±0.29×104/ml，較OVA/PBS組

8、均明顯降低（均P＜0.01）。
　　與PBS組相比，OVA/PBS組小鼠肺組織大量炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生、氣道分泌大量黏液(P＜0.01);OVA/ATO組氣道炎癥和黏液分泌狀態(tài)較OVA/PBS組有所減輕(P＜0.05)。
　　結論：
　　(1)本實驗中建立的急性哮喘小鼠模型是成功的;
　　(2)三氧化二砷能減輕急性哮喘小鼠的氣道高反應性及氣道炎癥。
　　第二章三氧化二砷誘導急性哮喘小鼠CD4+T細胞凋

9、亡。
　　目的：
　　檢測三氧化二砷干預對急性哮喘小鼠CD4+T細胞凋亡的影響。
　　方法：
　　在體部分:將18只SPF級BALB/c雌性小鼠隨機分為三組:正常組(PBS組)、哮喘組（OVA/PBS組）和三氧化二砷組(OVA/ATO組)，每組6只，按第一章中的方法建立急性哮喘小鼠模型，第25天處理小鼠，利用免疫磁珠分離純化各組小鼠脾CD4+T細胞，計數(shù)CD4+T細胞總數(shù)，然后用完全性RPMI-1640培養(yǎng)基按2

10、×106cell/ml的濃度接種細胞，同時加入ConA（5ug/ml）進行刺激，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用流式細胞術檢測細胞的凋亡率。
　　離體部分:免疫磁珠分離純化OVA/PBS組小鼠脾CD4+T細胞，然后用完全性RPMI-1640培養(yǎng)基按2×106cell/ml的濃度接種細胞，加入ConA(5ug/ml)進行刺激，同時分別加入四組不同濃度的三氧化二砷溶液(0μM，1μM，3μM，5μM)培養(yǎng)20小時，用流式細胞術檢測細胞的凋亡

11、率。計量資料以均數(shù)±標準差((x)±S)表示。各組數(shù)據(jù)先行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則經(jīng)自然對數(shù)轉換為正態(tài)分布的數(shù)據(jù)。若數(shù)據(jù)方差不齊，則行Dunnett's T3法。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)，各組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　在體部分:OVA/PBS組小鼠脾CD4+T細胞總數(shù)為(17.88±2

12、.13)×108/L，較PBS組顯著增多(P＜0.01); OVA/ATO組小鼠脾CD4+T細胞總數(shù)為(12.92±2.31)×108/L，較OVA/PBS組顯著減少(P＜0.05)。OVA/PBS組CD4+T細胞的凋亡率為20.69±2.68％，較PBS組顯著下降(P＜0.05);OVA/ATO組CD4+T細胞的凋亡率為34.71±0.98％，較OVA/PBS組顯著升高(P＜0.05)。
　　離體部分:3μM組CD4+T細胞的凋

13、亡率為31.85±3.73％，較0μM組顯著升高(P＜0.05);5μM組CD4+T細胞的凋亡率為40.54±1.99％，較0μM組和3μM組均顯著升高(P＜0.01和P＜0.05)。
　　結論：
　　三氧化二砷誘導急性哮喘小鼠CD4+T細胞的凋亡。
　　第三章內質網(wǎng)應激-CHOP途徑參與三氧化二砷誘導CD4+T細胞的凋亡。
　　目的：
　　(1)探討三氧化二砷干預對CD4+T細胞GRP78和CHOP蛋白表

14、達的影響;
　　(2)探索CHOP蛋白在三氧化二砷誘導CD4+T細胞凋亡中的作用。
　　方法：
　　第一部分:、免疫磁珠分離純化第一章中已建模成功的OVA/PBS組小鼠脾CD4+T細胞，體外加入5μM三氧化二砷，分別培養(yǎng)0h，2.5h，5h，7.5h后，檢測蛋白GRP78、CHOP的表達。
　　第二部分:將OVA/PBS組小鼠脾CD4+T細胞分成兩組:CHOP siRNA組和control siRNA組。首先，用

15、可以沉默CHOP表達的CHOP siRNA和無沉默效果的對照片段contol siRNA分別轉染兩組CD4+T細胞，轉染成功后，用real-timePCR和western blot分別檢測兩組CHOP mRNA和蛋白的表達，評估siRNA的沉默效果，達到滿意效果后加入5μM三氧化二砷培養(yǎng)20h，檢測各組細胞的凋亡率。
　　計量資料以均數(shù)±標準差((x)±S)表示。各組數(shù)據(jù)先行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則經(jīng)自然

16、對數(shù)轉換為正態(tài)分布的數(shù)據(jù)。若數(shù)據(jù)方差不齊，則行Dunnett's T3法。兩組均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)，各組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　ATO干預2.5h組，5h組，7.5h組GRP78蛋白的相對表達量較0h組均顯著增多（分別是P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）;5h組GRP

17、78蛋白的相對表達量較2.5h組和7.5h組均顯著升高（均P＜0.05）;而2.5h組GRP78蛋白的相對表達量與7.5h組之間未見明顯組間差異(P＞0.05)。
　　ATO干預5h組CHOP蛋白的相對表達量較0h組、2.5h組和7.5h組均顯著增多（均P＜0.05）;
　　CHOP siRNA組CHOP mRNA和蛋白的表達量較control siRNA組均顯著下降（均P＜0.01）;
　　予以ATO干預后CHOP