哮喘中Notch1對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞分化作用的調(diào)控研究.pdf

1、目的:研究哮喘大鼠肺CD4+T淋巴細(xì)胞中Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾和DNA甲基化水平，并分別使用HAT抑制劑、DNMT抑制劑和γ促分泌酶抑制劑compoundE干預(yù)哮喘大鼠肺CD4+T淋巴細(xì)胞，探討其對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞分化的作用機(jī)制。
　　方法:(1)卵清白蛋白致敏、激發(fā)建立哮喘大鼠模型，通過氣道高反應(yīng)性檢測(cè)、肺組織HE染色、BALF及血清細(xì)胞因子測(cè)定驗(yàn)證哮喘大鼠模型。(2)免疫磁珠法分離提取肺組織CD4+T淋巴細(xì)胞，r

2、eal-timePCR和Westernblot檢測(cè)Notch1和hes-1的mRNA和蛋白表達(dá)。(3)檢測(cè)肺CD4+T淋巴細(xì)胞HATs、HDACs的表達(dá)，ChIP檢測(cè)Notch1啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙酰化和組蛋白甲基化水平，并使用HAT抑制劑GAR干預(yù)哮喘CD4+T淋巴細(xì)胞，研究其對(duì)Notch1啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的影響及Th1/Th2細(xì)胞因子分泌、促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1表達(dá)的影響。(4)重亞硫酸鹽修飾和測(cè)序法檢測(cè)哮喘大鼠肺CD4+T

3、淋巴細(xì)胞Notch1啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化修飾水平，通過DNMT抑制劑5-Aza-CdR干預(yù)哮喘CD4+T淋巴細(xì)胞，研究其對(duì)Notch1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的影響和Th1/Th2細(xì)胞因子分泌、NF-κB和AP-1表達(dá)的影響。(5)γ促分泌酶抑制劑compoundE干預(yù)哮喘CD4+T淋巴細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)Notch信號(hào)通路，Th1/Th2上游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和Th1/Th2細(xì)胞因子分泌的影響。
　　結(jié)果:(1)成功建立哮喘大鼠模型。(2)與正常

4、對(duì)照組相比，哮喘大鼠肺CD4+T淋巴細(xì)胞中Notch1和hes-1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)哮喘大鼠肺CD4+T淋巴細(xì)胞P300和PCAF表達(dá)增加，HDAC1和HDAC2表達(dá)降低;Notch1啟動(dòng)子區(qū)總體H3，H4乙?；?，位點(diǎn)特異性H3K9，H3K14，H3K27，H3K18，H4K16乙酰化水平，位點(diǎn)特異性H3K4，H3K79三甲基化水平均明顯增加。GAR干預(yù)哮喘大鼠肺CD4+T淋巴細(xì)胞后，Notch

5、1啟動(dòng)子區(qū)總體H3和H4乙酰化水平，位點(diǎn)特異性H3K9，H3K14，H3K27，H3K18和H4K16乙酰化水平，位點(diǎn)特異性H3K79三甲基化水平均明顯降低。細(xì)胞上清IL-4，IL-5和IL-13表達(dá)降低，IFN-γ表達(dá)增加，細(xì)胞內(nèi)NF-κB和AP-1表達(dá)下降。(4)與正常對(duì)照組相比，哮喘大鼠肺CD4+T淋巴細(xì)胞Notch1啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平明顯降低，5-Aza-CdR干預(yù)哮喘CD4+T淋巴細(xì)胞后，Notch1啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化

6、水平無顯著變化，但細(xì)胞上清IL-4，IL-5和IL-13表達(dá)降低，IFN-γ表達(dá)增加，且細(xì)胞內(nèi)NF-κB和AP-1表達(dá)降低。(5)γ促分泌酶抑制劑compoundE干預(yù)哮喘CD4+T淋巴細(xì)胞后，Notch信號(hào)通路表達(dá)下調(diào)，GATA-3表達(dá)下降，T-bet表達(dá)增高，細(xì)胞上清IL-4，IL-5和IL-13表達(dá)降低，IFN-γ表達(dá)增加。
　　結(jié)論:哮喘Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾和DNA甲基化參與調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞分化，Gar