管氧與Notch1在急性T淋巴細(xì)胞白血病中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cellacutelymphoblasticleukemia，T-ALL)是一類以原始T淋巴細(xì)胞的增殖異常、分化障礙、凋亡受阻為特點(diǎn)的惡性克隆性疾病。Notch信號通路是細(xì)胞增殖與分化調(diào)控中的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其異常表達(dá)可造成造血系統(tǒng)惡性增殖性疾病。研究顯示超過一半的T-ALL患者存在Notch1信號的異常激活。
　　 乏氧是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，也是腫瘤易產(chǎn)生耐藥、療效差的

2、重要原因。研究證實(shí)，骨髓中存在乏氧環(huán)境，且大量增殖的白血病細(xì)胞及繼發(fā)性貧血可能使骨髓處于更加低氧的狀態(tài)。乏氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞可發(fā)生一系列基因表達(dá)的改變，其中乏氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-induciblefactors-1，HIF-1)是機(jī)體內(nèi)乏氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。HIF-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體是由α亞單位(HIF-1α)和β亞單位(HIF-1β)組成的異源二聚體。HIF-1α是受乏氧調(diào)節(jié)的亞基，在乏氧環(huán)境下迅速積聚，并激活下游基因表達(dá)，參與

3、紅細(xì)胞生成、血管形成和能量代謝的調(diào)節(jié)等生理過程。近年來在多種實(shí)體瘤中均發(fā)現(xiàn)乏氧環(huán)境下Notch信號通路的激活，提示HIF-1可能通過Notch通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和耐藥。
　　 第一部分
　　 乏氧環(huán)境下HIF-1α與Notch1通路活性的變化及其機(jī)制
　　 研究目的:
　　 研究HIF-1α與Notch1基因在乏氧環(huán)境下的表達(dá)水平;探討HIF-1α與Notch1可能存在的內(nèi)在聯(lián)系;闡明乏氧環(huán)境下

4、T-ALL細(xì)胞中HIF-1和Notch1的相互作用及作用機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.T-ALL細(xì)胞的乏氧培養(yǎng):將T-ALL細(xì)胞系Jurkat和Sup-T1置于乏氧環(huán)境下(2％O2，93％N2and5％CO2)培養(yǎng)，48h后應(yīng)用RealtimeRT-PCR和Westernblot檢測HIF-1α、Notch1mRNA和蛋白的表達(dá)變化。
　　 2.RealtimeRT-PCR方法檢測乏氧對HIF-1α和Not

5、ch1通路mRNA表達(dá)水平的影響:TRIzol方法提取細(xì)胞總RNA，使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用RealtimeRT-PCR檢測HIF-1α、VEGF、Notch1和Hes1基因mRNA水平的表達(dá)情況。
　　 3.Westernblot方法檢測乏氧對HIF-1α、Notch1通路蛋白表達(dá)水平的影響:應(yīng)用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，10％SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳，Westernblot方法檢測H

6、IF-1α、Notch1ICN和Hes1蛋白水平的表達(dá)情況。
　　 4.RBP-Jκ報(bào)告質(zhì)粒檢測乏氧環(huán)境對Notch信號水平的影響:將Jurkat細(xì)胞應(yīng)用LipofectamineLTXandPlusTM共轉(zhuǎn)染RBP-Jκ報(bào)告質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒。乏氧環(huán)境下培養(yǎng)48h后裂解細(xì)胞并收集裂解液，應(yīng)用Promega雙熒光素酶檢測試劑盒檢測信號強(qiáng)度。
　　 5.siRNA片段的轉(zhuǎn)染:應(yīng)用Lipofectamine2000分別將針對HI

7、F-1α、Notch1的siRNA片段轉(zhuǎn)染T-ALL細(xì)胞Sup-T1和Jurkat。72h后應(yīng)用RealtimeRT-PCR和Westernblot檢測siRNA片段對HIF-1α、Notch1mRNA和蛋白表達(dá)的阻斷效率。
　　 6.RealtimeRT-PCR檢測乏氧環(huán)境下阻斷HIF-1α/Notch對其信號通路基因表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為4組:正常對照組、陰性對照組、HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組和Notch1siRNA轉(zhuǎn)染

8、組。將T-ALL細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA片段后置于乏氧環(huán)境培養(yǎng)48h，Trizol方法提取組織總RNA，在一定的反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RealtimeRT-PCR方法檢測HIF-1α、Notch1，Hes1基因mRNA水平的表達(dá)情況。
　　 7.Westernblot檢測乏氧環(huán)境下阻斷HIF-1α/Notch對其信號通路蛋白表達(dá)的影響:將T-ALL細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA片段后置于乏氧環(huán)境培養(yǎng)48h，提取細(xì)胞總蛋白，Western-b

9、lot檢測HIF-1α、NotchlICN和Hes1蛋白的表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.乏氧下HIF-1α表達(dá)升高，激活Notch1信號通路:T-ALL細(xì)胞在乏氧環(huán)境下培養(yǎng)48h后與常氧比較，RealtimeRT-PCR顯示，HIF-1α的mRNA表達(dá)水平無明顯變化，但其下游基因VEGF表達(dá)升高;同時(shí)Notch1、Hes1基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。Westernblot顯示，HIF-1α蛋白呈高表達(dá)，且Notch1

10、ICN、Hes1蛋白表達(dá)水平上調(diào)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，乏氧環(huán)境能夠在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控Notch1信號通路活性。
　　 2.針對HIF-1α或Notch1的siRNA片段可以有效下調(diào)HIF-1α或Notch1表達(dá):siRNA轉(zhuǎn)染后72h，RealtimeRT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示所用siRNA片段可有效下調(diào)HIF-1α或Notch1的表達(dá)水平。
　　 3.乏氧誘導(dǎo)下Notch1通路的激活依賴于HIF

11、-1α:利用HIF-1αsiRNA下調(diào)HIF-1α表達(dá)后將T-ALL細(xì)胞置于乏氧下培養(yǎng)48h，RealtimeRT-PCR及Westemblot顯示HIF-1α、Notch1、Hes1表達(dá)水平均較陰性對照組降低。利用Notch1siRNA下調(diào)Notch1表達(dá)后將T-ALL細(xì)胞置于乏氧下培養(yǎng)48h，RealtimeRT-PCR及Westernblot顯示HIF-1α表達(dá)與陰性對照組比較無明顯變化，Notch1、Hes1表達(dá)水平均降低。

12、r>　　 結(jié)論:
　　 1.乏氧環(huán)境下T-ALL細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)增加。
　　 2.乏氧環(huán)境對T-ALL細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的調(diào)控發(fā)生在蛋白水平。
　　 3.乏氧環(huán)境能夠在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控T-ALL細(xì)胞中Notch1信號通路活性。
　　 4.乏氧環(huán)境對T-ALL細(xì)胞中Notch1信號通路的正調(diào)控作用依賴于乏氧下HIF-1α的激活。
　　 第二部分
　　 乏氧環(huán)境對T-ALL細(xì)胞生

13、物學(xué)行為及耐藥性的影響及其機(jī)制
　　 研究目的:
　　 研究T-ALL細(xì)胞在乏氧環(huán)境下生物學(xué)行為及耐藥性的改變;探討HIF-1α和Notch1信號通路在其中的作用，并闡明其作用機(jī)制，為該病的靶向治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1.乏氧對T-ALL細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。
　　 1.1CCK8實(shí)驗(yàn)檢測乏氧對T-ALL細(xì)胞增殖的影響:將T-ALL細(xì)胞系Jurkat和SupT

14、1分別置于常氧及乏氧環(huán)境下培養(yǎng)24h、48h、72h，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測乏氧對細(xì)胞增殖的影響。
　　 1.2流式細(xì)胞術(shù)檢測乏氧對細(xì)胞周期的影響:將T-ALL細(xì)胞系分別置于常氧及乏氧環(huán)境下培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，PI染色后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期變化。
　　 1.3Westernblot檢測乏氧對細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響:將T-ALL細(xì)胞系分別置于常氧及乏氧環(huán)境下培養(yǎng)48h，提取細(xì)胞總蛋白，檢測乏氧對細(xì)胞周期蛋白Cyclin

15、D1、CDK2、P21表達(dá)水平的影響。
　　 1.4阻斷HIF-1α或Notch1表達(dá)對細(xì)胞增殖及周期的影響:利用HIF-1α或Notch1siRNA分別下調(diào)HIF-1α或Notch1表達(dá)，將T-ALL細(xì)胞系置于乏氧環(huán)境下培養(yǎng)，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期改變;Westernblot檢測細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CDK2、P21表達(dá)水平。
　　 2.乏氧對T-ALL細(xì)胞侵襲能力的影響及其作用機(jī)

16、制。
　　 2.1Transwell實(shí)驗(yàn)檢測乏氧對T-ALL細(xì)胞侵襲能力的影響:將細(xì)胞置于包被好Matrigel的Transwell小室，分別于常氧及乏氧環(huán)境下培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。
　　 2.2RealtimeRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測乏氧對侵襲相關(guān)蛋白MMP2、MMP9mRNA表達(dá)水平的影響:將T-ALL細(xì)胞系分別于常氧及乏氧環(huán)境培養(yǎng)48h，Trizol方法提取組織總RNA，檢測乏氧對侵襲相關(guān)蛋白MMP2和MMP9m

17、RNA表達(dá)水平的影響。
　　 2.3Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測乏氧對侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響:將T-ALL細(xì)胞系分別置于常氧及乏氧環(huán)境下培養(yǎng)48h，提取細(xì)胞總蛋白，檢測乏氧對侵襲相關(guān)蛋白MMP2和MMP9表達(dá)水平的影響。
　　 2.4阻斷HIF-1α或Notch1表達(dá)對細(xì)胞增殖及周期的影響:利用HIF-1α或Notch1siRNA分別下調(diào)HIF-1α或Notch1表達(dá)，將T-ALL細(xì)胞系置于乏氧環(huán)境下培養(yǎng)，Tran

18、swell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力的改變;RealtimeRT-PCR及Westernblot檢測MMP2和MMP9表達(dá)水平。
　　 3.乏氧對T-ALL細(xì)胞耐藥性的影響及其作用機(jī)制。
　　 3.1T-ALL在乏氧環(huán)境下培養(yǎng)24h后，加入1μM地塞米松后置于乏氧環(huán)境培養(yǎng)48h。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Westernblot檢測乏氧對細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測乏氧對細(xì)胞耐藥性的影響:AnnexinV/PI雙染

19、后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化。
　　 3.3Westernblot檢測乏氧對細(xì)胞耐藥性的影響:提取細(xì)胞總蛋白，檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　 3.4阻斷HIF-1α或Notch1表達(dá)對細(xì)胞耐藥性的影響:利用HIF-1α或Notch1siRNA分別下調(diào)HIF-1α或Notch1表達(dá)，加入1μM地塞米松在乏氧環(huán)境下孵育48h收集細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

20、r>　　 研究結(jié)果:
　　 1.乏氧環(huán)境對T-ALL細(xì)胞具有明顯的促增殖作用。其促增殖作用與乏氧下Notch1信號通路的激活相關(guān)。
　　 1.1乏氧促進(jìn)T-ALL細(xì)胞增殖:CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，Jurkat和Sup-T1細(xì)胞在乏氧環(huán)境下的增殖速率顯著高于常氧環(huán)境。
　　 1.2乏氧環(huán)境下T-ALL細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例降低:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，Jurkat和Sup-T1細(xì)胞在乏氧環(huán)境下培養(yǎng)48h后，G

21、0/G1期細(xì)胞比例較常氧降低，同時(shí)S期和G2/M期細(xì)胞比例升高。
　　 1.3乏氧環(huán)境下細(xì)胞周期蛋白p21表達(dá)水平降低，CyclinD1和CDK2表達(dá)升高:Westernblot結(jié)果顯示，乏氧環(huán)境可下調(diào)p21表達(dá)水平，上調(diào)CyclinD1和CDK2表達(dá)，從而降低T-ALL細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例。
　　 1.4阻斷HIF-1α表達(dá)可顯著降低乏氧環(huán)境下T-ALL細(xì)胞增殖速率:利用HIF-1αsiRNA下調(diào)HIF-1α表達(dá)后

22、將細(xì)胞置于乏氧環(huán)境下培養(yǎng)，CCK8結(jié)果顯示，干擾組的增殖速率顯著低于陰性對照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，干擾組G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于陰性對照組。利用Westernblot檢測細(xì)胞周期蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，阻斷HIF-1α可升高T-ALL細(xì)胞乏氧環(huán)境下p21表達(dá)水平，降低CyclinD1和CDK2表達(dá)水平。
　　 1.5阻斷Notch1表達(dá)可抑制乏氧對T-ALL細(xì)胞的促增殖作用:利用Notch1siRNA阻斷Notch1表達(dá)

23、后將細(xì)胞置于乏氧環(huán)境下培養(yǎng)。CCK8結(jié)果顯示，干擾組的增殖速率顯著低于陰性對照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，干擾組G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于陰性對照組。利用Westernblot檢測細(xì)胞周期蛋白表達(dá)顯示，下調(diào)Notch1表達(dá)水平后T-ALL細(xì)胞在乏氧環(huán)境下p21蛋白表達(dá)較陰性對照組升高，CyclinD1和CDK2蛋白表達(dá)水平降低。
　　 2.乏氧環(huán)境下T-ALL細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。其作用機(jī)制與HIF-1α激活Notch1信

24、號通路相關(guān)。
　　 2.1乏氧環(huán)境下T-ALL細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng):Transwell結(jié)果顯示，乏氧環(huán)境下穿膜細(xì)胞數(shù)較常氧明顯升高。
　　 2.2乏氧環(huán)境下T-ALL細(xì)胞的MMP2和MMP9表達(dá)升高:Real-timeRT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示，乏氧培養(yǎng)可上調(diào)T-ALL細(xì)胞中侵襲相關(guān)蛋白MMP2和MMP9表達(dá)水平，從而引起侵襲能力的變化。
　　 2.3阻斷HIF-1α表達(dá)可顯著減弱乏氧環(huán)境下T-AL

25、L細(xì)胞的侵襲能力:利用HIF-1αsiRNA阻斷HIF-1α表達(dá)后將細(xì)胞置于乏氧環(huán)境下培養(yǎng)48h，Transwell結(jié)果顯示HIF-1α干擾組侵襲能力降低。Real-timeRT-PCR和Westernblot結(jié)果表明阻斷HIF-1α表達(dá)可顯著降低乏氧環(huán)境下MMP2和MMP9表達(dá)水平。
　　 2.4下調(diào)Notch1表達(dá)可抑制乏氧對T-ALL細(xì)胞的促侵襲作用:利用Notch1siRNA阻斷Notch1表達(dá)后將細(xì)胞置于乏氧環(huán)境下培養(yǎng)

26、48h，Transwell結(jié)果顯示干擾組侵襲能力較陰性對照組顯著降低。Real-timeRT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示干擾組在乏氧環(huán)境下MMP2和MMP9表達(dá)降低。
　　 3.乏氧環(huán)境下T-ALL細(xì)胞對化療藥物地塞米松的耐藥性增強(qiáng)。其作用機(jī)制與HIF-1α激活Notch1信號通路相關(guān)。
　　 3.1乏氧環(huán)境下T-ALL細(xì)胞對化療藥物地塞米松的耐藥性增強(qiáng):利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率顯示，乏氧下地塞米松誘導(dǎo)細(xì)

27、胞凋亡率低于常氧。
　　 3.2乏氧環(huán)境可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表達(dá):Westernblot結(jié)果顯示，乏氧環(huán)境下T-ALL細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)升高，從而降低caspase9、caspase3的活性，使地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率下降。
　　 3.3下調(diào)HIF-1α后T-ALL細(xì)胞在乏氧環(huán)境下的化療藥物敏感性增強(qiáng):利用HIF-1αsiRNA阻斷HIF-1α表達(dá)后，加入1μM地塞米松在乏氧環(huán)

28、境下培養(yǎng)48h。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，下調(diào)HIF-1α后地塞米松在乏氧環(huán)境下的誘導(dǎo)凋亡率顯著升高。Westernblot結(jié)果表明HIF-1α干擾組Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)較陰性對照組下調(diào)，caspase9、caspase3及PARP的活性片段表達(dá)上調(diào)。
　　 3.4阻斷Notch1表達(dá)后T-ALL細(xì)胞在乏氧環(huán)境下的耐藥性降低:利用Notch1siRNA阻斷Notch1表達(dá)，加入1μM地塞米松在乏氧環(huán)境下培養(yǎng)48h

29、，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，Notch1干擾組細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對照組。Westernblot結(jié)果顯示下調(diào)Notch1表達(dá)可降低Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)水平，使caspase9、caspase3及PARP的活性提高。
　　 結(jié)論:
　　 1.乏氧與HIF-1α可促進(jìn)T-ALL細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力，增加細(xì)胞耐藥性。其功能的發(fā)揮依賴于HIF-1α作用下Notch1信號通路的激活。
　　 2.