miR-16調(diào)節(jié)小鼠腹腔巨噬細胞極化及其對CD4+T細胞功能的影響.pdf

1、目的:
　　本研究擬探討miR-16對小鼠腹腔巨噬細胞M1/M2極化的調(diào)控作用及其對CD4+T細胞功能的影響，為抗腫瘤免疫治療提供新的潛在干預靶點。
　　方法:
　　1.miR-16對小鼠腹腔巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)作用
　　1.1 以100ng/ml IFN-γ及20 ng/ml LPS刺激C57BL/6小鼠腹腔來源巨噬細胞48h將其誘導成M1型巨噬細胞模型，以20 ng/ml IL-4刺激C57BL/6小鼠腹腔來源

2、巨噬細胞48h將其誘導成M2型巨噬細胞模型。我們選取了CD16/32、IL-12和iNOS作為M1型巨噬細胞的標記物，CD206，Dectin-1和IL-10作為M2型巨噬細胞的標記物，利用流式細胞儀檢測巨噬細胞CD16/32、CD206和Dectin-1的表達，ELISA法檢測腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中IL-10和IL-12的濃度，Griess法測定小鼠腹腔巨噬細胞iNOS的活性水平，以驗證兩型巨噬細胞的成功獲得。
　　1.2 我們

3、用慢病毒感染小鼠腹腔原代巨噬細胞和IL-4誘導形成的M2型巨噬細胞，使其過表達miR-16，分別用流式細胞儀檢測腹腔巨噬細胞CD16/32、CD206和Dectin-1的表達，ELISA法檢測腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中IL-10和IL-12的分泌，Griess法測定腹腔巨噬細胞iNOS的活性水平，以探究miR-16對小鼠腹腔巨噬細胞的表型和功能的影響。
　　2.miR-16影響M2型巨噬細胞極化后對CD4+T細胞功能的影響及其可能機制

4、
　　2.1 采用M2型巨噬細胞與CD4+T淋巴細胞體外共培養(yǎng)的方法，流式細胞術檢測T細胞表面早期活化標志CD69的表達，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-2和IFN-γ的分泌，以研究miR-16影響M2型巨噬細胞表型和功能后對CD4+T淋巴細胞功能的影響。
　　2.2 利用Mirbase、Targetscans、PicTar等基因預測軟件查找miR-16可能的潛在靶基因，以探索miR-16影響M2型巨噬細胞極化的可能機制。

5、
　　2.3 將慢病毒介導的miR-16導入IL-4誘導形成的M2型巨噬細胞使其過表達miR-16，利用Western Blot檢測PD-L1蛋白的表達情況，以驗證miR-16是否通過調(diào)控PD-L1蛋白的表達而影響腹腔巨噬細胞的極化。
　　結果:
　　1.體外實驗表明，miR-16促進M1型巨噬細胞的極化，抑制M2型巨噬細胞的極化。
　　1.1 經(jīng)IFN-γ和LPS處理的小鼠腹腔巨噬細胞CD16/32表達上調(diào)，I

6、L-12產(chǎn)生明顯增加，iNOS的活性水平增加，符合M1型巨噬細胞的特點;經(jīng)IL-4處理的小鼠腹腔巨噬細胞CD206和Dectin-1表達上調(diào)，IL-10產(chǎn)生明顯增加，符合M2型巨噬細胞特點。
　　1.2 慢病毒介導的miR-16感染小鼠腹腔原代巨噬細胞后，CD16/32表達增加，CD206和Dectin-1表達無明顯變化，iNOS的活性水平增加，IL-12分泌增加，IL-10變化不明顯，表現(xiàn)出類似M1型巨噬細胞的特點。
　　

7、1.3 慢病毒介導的miR-16感染IL-4誘導形成的M2型巨噬細胞后，CD16/32表達上調(diào)，CD206，Dectin-1表達下調(diào)，iNOS的活性水平增加，IL-12產(chǎn)生增加，IL-10分泌降低，其特點傾向于M1型巨噬細胞。
　　2.miR-16抑制M2型巨噬細胞的表型和功能，進而促進CD4+T細胞的功能，其可能通過影響PD-L1蛋白的表達來實現(xiàn)。
　　2.1 在體外共培養(yǎng)體系中，與對照組相比，與過表達miR-16的M2型