慢性毒介導(dǎo)的miR-16高表達(dá)對(duì)小鼠垂體瘤細(xì)胞影響的初步研究.pdf

1、近年來備受關(guān)注的一類普遍存在于動(dòng)、植物和病毒中的非編碼小RNA(ncRNA)-微小RNA(miRNAs)被認(rèn)為是人體內(nèi)最大的一類基因表達(dá)調(diào)控因子，調(diào)控超過30％的蛋白編碼基因的表達(dá)，影響著幾乎所有的信號(hào)通路，參與多種生理病理過程。通過調(diào)控基因的表達(dá)，miRNA在生物的生命過程中起著非常重要的作用，廣泛參與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病發(fā)生等各種生命過程。
　　 作為一種可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性小分子，miRNA在腫瘤的基因治療中具有許多獨(dú)特

2、的優(yōu)勢(shì)。盡管miRNA與siRNA(short/small interfering RNA)起作用的方式相似，但典型的miRNA是靶向多個(gè)基因而不是一個(gè)基因。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是受到多個(gè)基因的調(diào)控，單靶點(diǎn)基因治療策略在臨床上存在較大的局限，而針對(duì)miRNA靶點(diǎn)的治療是多靶點(diǎn)聯(lián)合治療對(duì)于腫瘤的基因治療較單靶點(diǎn)治療更有優(yōu)勢(shì)，更有利于腫瘤的控制。依據(jù)內(nèi)源性miRNA特異性調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)理，miRNA模擬物(mimics)或抑制物(inhibit

3、ors)也逐漸被用于靶向抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，克服了先前針對(duì)單個(gè)基因靶向治療效果差的弱點(diǎn)。
　　 miR-16-1作為發(fā)現(xiàn)最早和研究最廣泛的miRNAs之一，在人類miRNAs的功能研究中發(fā)揮了不容忽視的作用。miR-16是第一次將miRNAs和腫瘤聯(lián)系起來的兩個(gè)miRNAs之一，也是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)有腫瘤抑制作用的miRNAs。Calin等發(fā)現(xiàn)hsa-miR-15a-16-1簇位于慢性B淋巴細(xì)胞白血病中經(jīng)常缺失的13q14.3片段

4、中，這兩個(gè)miRNAs在68％的淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)缺失或降低。Cimmino等研究表明，在CLL中，hsa-miR-16-1和hsa-miR-15a在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控抗凋亡基因Bcl-2，且在CLL的模式細(xì)胞中用這兩個(gè)miRNAs的模擬物抑制Bcl-2表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說明這兩個(gè)miRNAs是Bcl-2的天然反義因子，可被用于治療Bcl-2高表達(dá)的腫瘤。Bonci等在前列腺癌中研究發(fā)現(xiàn)miR-16-1及miR-15a在晚期前列腺癌中

5、顯著降低，過表達(dá)miR-16-1和miR-15a后通過靶向CCND1、Bcl-2和WNT3A抑制了細(xì)胞存活、增殖和侵襲，說明miR-16-1及miR-15a有治療意義。垂體瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)繼膠質(zhì)瘤和腦膜瘤之后第三位最常見的原發(fā)顱內(nèi)腫瘤，嚴(yán)重影響患者的生活及生存質(zhì)量，且手術(shù)后復(fù)發(fā)率高。近年，miRNAs在垂體腺瘤中的研究亦日益增多，多個(gè)研究表明miR-16-1在垂體腺瘤中較正常垂體低表達(dá)，且與幾個(gè)臨床因素相關(guān)，說明miR-16-1可能在垂

6、體瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，而有關(guān)miR-16在垂體瘤細(xì)胞的作用及可能的作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。
　　 本研究先驗(yàn)證mmu-miR-16在AtT20細(xì)胞株低表達(dá)后，再通過設(shè)計(jì)能夠在小鼠AtT20垂體瘤細(xì)胞株中穩(wěn)定高效表達(dá)miR-16的慢病毒重組載體，研究該病毒載體感染AtT20細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞的增殖與凋亡水平變化，明確miR-16能否作為未來進(jìn)行垂體瘤基因治療的有效靶點(diǎn)，Bcl-2及CCND1是否是mmu-miR-16的垂體瘤

7、相關(guān)的潛在靶基因，為垂體瘤產(chǎn)生和發(fā)展的分子機(jī)制研究以及新治療方法的尋找提供新的線索和思路。
　　 第一部分 miR-16在小鼠正常垂體細(xì)胞和垂體瘤細(xì)胞表達(dá)的差異
　　 目的:檢測(cè)mmu-miR-16在小鼠正常垂體細(xì)胞和AtT20細(xì)胞株的差異性表達(dá)，確定AtT20細(xì)胞株是否是miR-16功能研究的體外模式細(xì)胞。
　　 方法:分別用培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠AtT20細(xì)胞株及小鼠正常垂體細(xì)胞。采用莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)來

8、檢測(cè)mmu-miR-16在這兩株細(xì)胞的表達(dá)水平。先用RNAiso Plus試劑盒分別抽提兩種細(xì)胞的總RNA，用莖凸環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用miR-16特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，U6作為內(nèi)參。mmu-miR-16的相對(duì)表達(dá)量用2-⊿⊿Ct方法計(jì)算，用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析。
　　 結(jié)果:mmu-miR-16在小鼠垂體瘤細(xì)胞系A(chǔ)tT20的表達(dá)水平較小鼠正常垂體細(xì)胞明顯下降，兩者有顯著性差異(P<0.05

9、)，在AtT20細(xì)胞株的表達(dá)量是正常垂體細(xì)胞的0.337倍。
　　 結(jié)論:
　　 1、mmu-miR-16在小鼠垂體瘤細(xì)胞系A(chǔ)tT20的表達(dá)水平較小鼠正常垂體細(xì)胞明顯下降，提示miR-16的異常表達(dá)與垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系。
　　 2、AtT20細(xì)胞系可作為miR-16在垂體瘤中的功能研究的模式細(xì)胞。
　　 第二部分 miR-16慢病毒載體的制備、病毒的大量包裝及表達(dá)檢測(cè)
　　 目的:構(gòu)建

10、有效的慢病毒表達(dá)載體，并篩選出高效的表達(dá)載體。
　　 方法:將mmu-miR-16-1基因序列導(dǎo)入Vector軟件，依據(jù)miRNA表達(dá)最優(yōu)原則在Vector中搜尋最優(yōu)序列2條，經(jīng)單鏈片段的合成和退火后，分別克隆至pMAGic1.0載體的U6下游合適的酶切位點(diǎn)處，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒pMD2G、包裝質(zhì)粒pMD1g-pRRE及REV表達(dá)質(zhì)粒pRSV-Rev共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒，48h后收集細(xì)胞上清，經(jīng)

11、過濾后得到病毒原液，用Real-time PCR方法檢測(cè)病毒滴度，并感染AtT20細(xì)胞株后檢測(cè)miR-16的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:設(shè)計(jì)出2個(gè)特異的RNA序列，即miR-16-1-a和miR-16-1-b，成功構(gòu)建了兩個(gè)重組慢病毒：pMAGic-miR-16-1-a和pMAGic-miR-16-1-b，測(cè)定病毒滴度結(jié)果為：pMAGic-miR-16-1-a重組慢病毒為1.015×108TU/TU/，pMAGic-miR-16-1

12、-b重組慢病毒為1.026×108TU/ml。Real-time PCR檢測(cè)了兩個(gè)慢病毒表達(dá)載體感染AtT20細(xì)胞株后miR-16的表達(dá)，其中pMAGic-miR-16-1-b重組慢病毒上調(diào)最為明顯(為感染前的3.6倍)，優(yōu)于pMAGic-miR-16-1-a重組慢病毒(僅為感染前的1.76倍)。
　　 結(jié)論:
　　 1、根據(jù)mmu-miR-16-1基因序列利用Vector軟件設(shè)計(jì)出2個(gè)特異性的RNA序列。
　　

13、 2、成功構(gòu)建了能表達(dá)miR-16的兩組慢病毒表達(dá)載體：pMAGic-miR-16-1-a及pMAGic-miR-16-1-b慢病毒表達(dá)載體。
　　 3、成功篩選出能高效表達(dá)miR-16的慢病毒表達(dá)載體慢病毒。該載體能有效感染AtT20細(xì)胞株，滿足實(shí)驗(yàn)要求。該載體的成功構(gòu)建為深入開展mmu-miR-16對(duì)AtT20細(xì)胞株的生物學(xué)功能和靶標(biāo)研究提供了有效的工具。
　　 4、選擇合適的MOI，能夠在低毒性的同時(shí)達(dá)到較高的感染

14、效率，而較高的MOI在AtT20細(xì)胞中產(chǎn)生較明顯的非特異性的毒性作用。
　　 第三部分 miR-16高表達(dá)對(duì)垂體瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制
　　 目的:檢測(cè)高效表達(dá)mmu-miR-16的pMAGic-miR-16-1-b慢病毒重組載體感染AtT20細(xì)胞株后對(duì)細(xì)胞株增殖與凋亡水平的影響，闡明miR-16在腫瘤發(fā)生過程中的可能作用；檢測(cè)Bcl-2及CCND1是否為miR-16垂體腺瘤相關(guān)的潛在靶基因。
　　 方法:

15、將小鼠AtT20細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組不加任何處理，陰性對(duì)照組加入GFP病毒，而實(shí)驗(yàn)組加入pMAGic-miR-16-1-b慢病毒表達(dá)顆粒(MOI=30)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)(MTT)方法來測(cè)定各組細(xì)胞的細(xì)胞周期、凋亡及增殖變化。應(yīng)用Real-timePCR及western blot檢測(cè)Bcl-2及CCND1的mRNAs及蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果:MTT結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)速度較

16、空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯降低，曲線較平坦，而陰性對(duì)照線曲線較空白對(duì)照組略低。流式細(xì)胞儀結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組凋亡率明顯增加，較陰性對(duì)照及空白對(duì)照組有顯著性差異，而兩對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞周期結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組G0/G1期前有明顯的亞二倍體峰。實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯降低，而CCND1蛋白及mRNA水平較對(duì)照組略下降。
　　 結(jié)論:
　　 1、miR-16在垂體瘤細(xì)胞中扮演著抑制腫瘤的角色，通

17、過感染miR-16慢病毒可有效提高miR-16的抑瘤效應(yīng)。
　　 2、上調(diào)mmu-miR-16通過靶向Bcl-2可抑制AtT20細(xì)胞的增殖，促進(jìn)AtT20細(xì)胞的凋亡。
　　 3、Bcl-2是mmu-miR-16與垂體腺瘤相關(guān)的潛在靶基因，在垂體瘤中呈高表達(dá)，上調(diào)mmu-miR-16可降低其表達(dá)。
　　 4、miR-16是垂體瘤基因治療的候選靶點(diǎn)。
　　 5、對(duì)于CCND1是否為miR-16與垂體腺瘤相關(guān)的