脾臟巨噬細胞通過exosomes傳遞抗原給樹突狀細胞參與CD4+T細胞免疫反應(yīng).pdf

1、目的：
　　以當(dāng)前國內(nèi)外尚未深入探討的體內(nèi)巨噬細胞和樹突狀細胞在免疫反應(yīng)中的相互作用的研究現(xiàn)狀為契機，以現(xiàn)代細胞免疫學(xué)和分子免疫學(xué)方法為研究手段。聯(lián)合應(yīng)用Baft3-/-和CX3 CR1GFP/GFP等各種缺陷鼠模型，研究脾臟巨噬細胞和樹突狀細胞在抗原誘導(dǎo)的CD4+T細胞免疫反應(yīng)中的作用，為闡明體內(nèi)專職抗原提呈細胞參與和調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答的機理提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.C57BL/6小鼠胸腺單細胞懸液經(jīng)

2、20Gy X射線輻照誘導(dǎo)凋亡后，10mg/ml的OVAⅥ級蛋白及含有1％BSA1640培養(yǎng)基37℃孵育4h，制備細胞相關(guān)抗原。
　　2.C57BL/6小鼠尾靜脈回輸標記有e450熒光染料的CD45.1細胞相關(guān)抗原，1h后處死小鼠，制備脾臟單細胞懸液;同時留取脾臟組織進行冰凍切片。通過FACS及免疫組織熒光染色分析小鼠脾臟內(nèi)吞噬細胞吞噬抗原的能力。
　　3.C57BL/6小鼠尾靜脈注射脂質(zhì)體（200ul/只）后day1、5、1

3、2的前一日尾靜脈回輸106個CD45.1與OTⅡ雜交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細胞（標記e450），并于當(dāng)日尾靜脈回輸細胞相關(guān)抗原，同時設(shè)正常C57BL/6小鼠為正常對照組，3d后檢測CD4+CD45.1+T細胞增殖比例、e450分裂峰及細胞絕對計數(shù)。
　　4.Batf3/轉(zhuǎn)基因小鼠尾靜脈回輸CD45.1與OTⅡ雜交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細胞，次日尾靜脈回輸細胞相關(guān)抗原，同時設(shè)正常C57BL/6小鼠為正常對照組，3

4、d后檢測CD4+CD45.1+的增殖比例及細胞絕對計數(shù)。
　　5.C57BL/6小鼠尾靜脈回輸細胞相關(guān)抗原1h后分選其脾臟巨噬細胞及DC，同時分選OTⅡ小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細胞（標記e450），進行巨噬細胞與T細胞，DC與T細胞，巨噬細胞、DC共同與T細胞體外共培養(yǎng)，96h后檢測T細胞的增殖。
　　6.分選回輸細胞相關(guān)抗原（標記e450）1h后的脾臟巨噬細胞與Naive小鼠的脾臟DC共培養(yǎng)，分別于1h、3h、4h

5、、5h，F(xiàn)ACS檢測巨噬細胞向DC傳遞細胞相關(guān)抗原(e450+)的能力。
　　7.分選回輸細胞相關(guān)抗原(標記e450)1h后的脾臟巨噬細胞，Naive小鼠的脾臟DC以及DC、巨噬細胞共同與T細胞共培養(yǎng)3d后，檢測CD4+CD45.1+的增殖比例和e450的分裂峰。
　　8.C57BL/6小鼠尾靜脈回輸CD45.1與OTⅡ雜交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細胞（標記e450），次日腹腔注射G蛋白偶聯(lián)受體抑制劑百日咳毒素(PT

6、x)500ng/只，8h后尾靜脈回輸細胞相關(guān)抗原，同時再次腹腔注射百日咳毒素(PTx)500ng/只，同時設(shè)正常C57BL/6小鼠為正常對照組，3d后檢測CD4+CD45.1+的增殖比例，e450的分裂峰并進行細胞絕對計數(shù)。
　　9.CX3CR1GFP/GFP小鼠尾靜脈回輸CD45.1與OTⅡ雜交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細胞（標記e450），次日尾靜脈回輸細胞相關(guān)抗原，同時設(shè)正常C57BL/6小鼠為正常對照組，3d后檢測C

7、D4+CD45.1+的增殖比例， e450的分裂峰并進行細胞絕對計數(shù)。
　　10.C57BL/6小鼠連續(xù)2d腹腔注射exosome抑制劑GW4869（1.25mgkg/天），第3d同時尾靜脈回輸CD45.1與OTⅡ雜交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細胞，第4d同時尾靜脈回輸細胞相關(guān)抗原，之后再連續(xù)2d腹腔注射GW4869，第7d檢測CD4+CD45.1+的增殖比例， e450的分裂峰并進行細胞絕對計數(shù)。設(shè)立腹腔注射GW4869溶

8、解劑DMSO(50ul/只/天)小鼠為對照組。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠脾臟內(nèi)多種吞噬細胞具有吞噬細胞相關(guān)抗原的能力，其中包括巨噬細胞（吞噬細胞相關(guān)抗原總量的16％）、LDC(吞噬細胞相關(guān)抗原總量的19％) mDC（吞噬細胞相關(guān)抗原總量的1.5％）和pDC（吞噬細胞相關(guān)抗原總量的3.2％）等專職抗原提呈細胞以及小吞噬細胞如中性粒細胞（吞噬細胞相關(guān)抗原總量的18.6％）。
　　2.靜脈注射脂質(zhì)體1d后，與正常對照組相比，

9、注射CL組中脾臟mDC的清除率為50％，LDC清除率為99％，cDC清除率為50％，F(xiàn)4/80+ MФ清除率為100％，同時通過免疫熒光染色觀察CD169和Marco兩群巨噬細胞基本全部清除;注射CL5d后，mDC、LDC及cDC基本完全恢復(fù);而F4/80 MФ清除率仍為100％，CD169和Marco兩群巨噬細胞也基本全部清除;注射CL12d后，F(xiàn)4/80 MФ恢復(fù)到正常水平的67％，CD169和Marco兩群巨噬細胞大部分恢復(fù)。

10、r>　　3.注射CL1d、5d、12d后，與正常對照組相比，CD4+CD45.1+T細胞增殖的比例分別下降80％、60％、20％。
　　4.與正常對照組相比，Batf3/-轉(zhuǎn)基因小鼠中CD4+CD45.1+T細胞增殖的比例下降70％。
　　5.巨噬細胞與T細胞共培養(yǎng)3d后， T細胞增殖微弱(e-450分裂峰陽性率為3.39％);巨噬細胞與T細胞共培養(yǎng)后，T細胞增殖的e-450分裂峰陽性率為22.6％;DC、巨噬細胞共同與T細

11、胞共培養(yǎng)時，T細胞增殖的e-450分裂峰陽性率為38.1％。結(jié)果顯示:脾臟巨噬細胞與DC各自與T細胞培養(yǎng)時，其T細胞的增殖均低于這兩群細胞共同與T細胞培養(yǎng)組。
　　6.回輸細胞相關(guān)抗原（標記e450）1h后的脾臟巨噬細胞與Naive小鼠的脾臟DC共孵育1h、3h、4h、5h后，巨噬細胞向DC傳遞抗原的百分比分別為0.12％，0.7％，1.07％和1.55％。結(jié)果顯示，隨著時間延長，F(xiàn)4/80+巨噬細胞向DC傳遞抗原的數(shù)量亦在增加。

12、
　　7.回輸細胞相關(guān)抗原（標記e450）1h后的脾臟巨噬細胞，Naive小鼠的脾臟DC以及DC、巨噬細胞共同與T細胞共培養(yǎng)后，T細胞增殖的e-450分裂峰陽性率分別為33.5％，2.97％，55.6％;結(jié)果顯示，DC、巨噬細胞共同與T細胞共培養(yǎng)后，抗原特異的CD4+T細胞增殖能力明顯上調(diào)
　　8.小鼠腹腔注射PTx阻止細胞遷移后，CD4+CD45.1+T細胞增殖的比例與正常對照組相比下降70％。CX3CR1GFP/GFP小