硫酸鎂對(duì)UUO大鼠模型Nox4、TGF-β1、p-ERK1-2及Ⅲ型膠原表達(dá)的影響.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化（Renal interstitial fibrosis RIF）幾乎是所有慢性腎臟疾病的最終結(jié)果，與慢性腎衰竭進(jìn)展密切相關(guān)，是導(dǎo)致終末期腎病的主要病因。腎間質(zhì)纖維化往往伴隨著腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，多種導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的致病因素，如代謝因素、梗阻因素、炎癥反應(yīng)等，均可引起腎臟局部的氧化應(yīng)激增強(qiáng)，活性氧（ROS）生成增加，氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致腎

2、組織進(jìn)一步損傷，最終導(dǎo)致腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化。氧化應(yīng)激反應(yīng)是腎間質(zhì)纖維化形成的關(guān)鍵因素之一，可刺激各種細(xì)胞因子、激活多條信號(hào)通路等，對(duì)腎纖維化過程中EMT的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。近年來NADPH氧化酶家族（NOXS）在糖尿病、高血壓腎損害、5/6腎切除等多種腎臟病理模型中被確認(rèn)為是腎臟局部氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要促氧化系統(tǒng)。許多研究發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）及其下游因子如胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）是誘發(fā)ETM的關(guān)鍵因子，但這一過程是否

3、通過NADPH氧化酶調(diào)節(jié)研究尚少。硫酸鎂在缺血性腦卒中等疾病中有抗氧化作用，但在保護(hù)腎間質(zhì)纖維化方面未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過硫酸鎂干預(yù)，觀察其對(duì)SD大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型中TGF-β、Nox4、磷酸化(p)-ERK1/2及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響，研究 NADPH氧化酶是否參與TGF-β/ROS/ERK這一過程的調(diào)節(jié)，探討硫酸鎂保護(hù)腎臟的可能機(jī)制，為延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展提供新的治療靶點(diǎn)。
　　方法：采用單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）

4、模型，將72只清潔級(jí)SD大鼠(雄性，180～220g)，隨機(jī)分為A、B、C、D4組：假手術(shù)組（行手術(shù)分離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎）、模型組(結(jié)扎左側(cè)輸尿管近腎盂段)、高劑量硫酸鎂組及低劑量硫酸鎂組。假手術(shù)及模型組每天均給予等量生理鹽水腹腔注射。高劑量硫酸鎂組、低劑量硫酸鎂組分別給予硫酸鎂300mg/kg/d、100mg/kg/d腹腔注射。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由攝食水，每天注意觀察SD大鼠的一般狀況如精神、飲食、活動(dòng)。分別于術(shù)后第3、7、14天每組各

5、取6只SD大鼠，取左側(cè)梗阻腎組織后予以處死。用0.9％鹽水充分清洗腎組織后，并將其分為大小2個(gè)部分，取其中一小部分腎組織放入10%福爾馬林溶液固定，用以做病理切片及免疫組織化學(xué)染色；將另外一部分腎組織放入液氮使其迅速冷凍，以防止蛋白降解，并保存在-80℃冰箱中，用以做Western blot實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.腎臟組織病理形態(tài)

6、改變
　　1.1 肉眼觀察：新鮮的A組腎臟組織顏色、大小均正常；B、C、D三組梗阻側(cè)腎臟組織隨時(shí)間延長(zhǎng)均有不同程度增大，可見腎內(nèi)積水，腎皮質(zhì)變薄，其中尤以B組腎臟增大、腎內(nèi)積水最為明顯，C、D組腎臟組織顏色、大小均較B組輕。
　　1.2 光鏡觀察：
　　1.2.1 HE染色
　　觀察A組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球及腎小管無異常改變。B組大鼠可見腎小管上皮細(xì)胞脫落、壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)腎間質(zhì)，腎間質(zhì)增寬，間質(zhì)纖維化，腎

7、小管擴(kuò)張、萎縮、塌陷，基底膜彌漫性增厚，并且隨著病變時(shí)間的延長(zhǎng)，腎間質(zhì)、小管的結(jié)構(gòu)基本消失；而腎小球病變程度不一。C、D組與B組比較病變程度均有所減輕。C組較D組減輕明顯。
　　1.2.2 Masson染色
　　A組顯示腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管及腎間質(zhì)未見明顯異常。B組Masson染色可見腎小管廣泛擴(kuò)張，腎間質(zhì)較前增寬，間質(zhì)組織、細(xì)胞較前增多，腎間質(zhì)可見膠原纖維沉積，隨著病變進(jìn)展膠原纖維逐漸向腎組織周圍延伸，并且相互交織成“網(wǎng)

8、狀”。C、D組與B組比較均有不同程度的減輕。C組較D組減輕明顯。
　　2.免疫組化結(jié)果
　　2.1 TGF-β1：A組，SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)很弱；B組，腎組織小管上皮細(xì)胞中TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，隨著病變的進(jìn)展持續(xù)增加，且與同時(shí)相A組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；C、D組，TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)與同一時(shí)期B組相比較均有明顯下降(P<0.05)，但仍高于同一時(shí)相A組中(P<0.05)的陽(yáng)性表

9、達(dá)水平，同期C、D兩組比較，C組陽(yáng)性表達(dá)水平較D組顯著下降(P<0.05)。
　　2.2 Nox4:A組，SD大鼠腎組織中Nox4陽(yáng)性表達(dá)很弱；B組，陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，且隨著病變的進(jìn)展，其表達(dá)水平持續(xù)增加，且與同一時(shí)期 A組相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；C、D組與同期B組相比，Nox4的陽(yáng)性表達(dá)均有顯著下降(P<0.05)，但與同期A組相比Nox4的表達(dá)水平仍明顯增高(P<0.05)，而同期C、D兩組比較，C組表達(dá)水平較D

10、組明顯下降(P<0.05)。
　　2.3 p-ERK1/2：A組，在腎小管上皮細(xì)胞核中有一定水平的表達(dá)；B組，腎小管上皮細(xì)胞核中出現(xiàn)廣泛水平的表達(dá)，隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平呈進(jìn)行性升高，且與A組同時(shí)相相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；C、D組，p-ERK1/2的表達(dá)水平與同期 B組表達(dá)水平相比較均有顯著下降(P<0.05)，但仍高于同期A組中(P<0.05)的表達(dá)水平，同期C、D兩組比較，C組表達(dá)水平較D組顯著下降(P<

11、0.05)。
　　2.4 Ⅲ型膠原蛋白：正常情況下在腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及腎小球系膜細(xì)胞胞漿中有少量表達(dá)。A組，腎小管上皮細(xì)胞中可見少量表達(dá)；B組，腎小管上皮細(xì)胞中可見表達(dá)，隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平呈進(jìn)行性升高，且與A組同時(shí)相相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；C、D組，Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平與同期B組表達(dá)水平相比較均有顯著下降(P<0.05)，但仍高于同期A組(P<0.05)的表達(dá)水平，同期C、D兩組比較，C組表達(dá)水

12、平較D組顯著下降(P<0.05)。
　　3.Western Blot結(jié)果
　　Western實(shí)驗(yàn)Nox4蛋白的表達(dá)：與同期A組相比，B組Nox4蛋白表達(dá)均增加（P<0.05），各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。C、D組，Nox4蛋白的表達(dá)水平與同期B組表達(dá)水平相比較均有顯著下降(P<0.05)，但仍高于同期A組中(P<0.05)的表達(dá)水平，同期C、D兩組比較，C組表達(dá)水平較D組顯著下降(P<0.05)。
　　結(jié)論：