七氟醚預(yù)處理抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：(1)建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外培養(yǎng)方法，探討腫瘤壞死因子-α(WNF-α)對(duì)HUVEC表達(dá)細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)、血管細(xì)胞間粘附分子(VCAM-1)的影響，篩選出TNF-α誘導(dǎo)粘附分子表達(dá)的最適濃度和時(shí)間；研究七氟醚預(yù)處理對(duì)HUVEC表達(dá)ICAM-1、VCAM-1及中性粒細(xì)胞粘附的影響；(2)研究七氟醚預(yù)處理對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的影響，為七氟醚預(yù)處理抗炎作用的機(jī)制提供理論和

2、實(shí)驗(yàn)依據(jù)；(3)探討eNOS-NO信號(hào)系統(tǒng)對(duì)七氟醚預(yù)處理在體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞抗炎效應(yīng)的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分：(1)原代細(xì)胞培養(yǎng)參照參考文獻(xiàn)報(bào)道方法并加以改進(jìn)，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定；應(yīng)用Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)不同濃度TNF-α(0、1ng/ml、2.5ng/ml、10ng,/ml、40n/ml)處理內(nèi)皮細(xì)胞4小時(shí)，以及TNF-α(10ng/ml)作用不同時(shí)

3、間(0、2h、4h、12h)后ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA的表達(dá)，確定TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子穩(wěn)定表達(dá)的最佳作用濃度和時(shí)間；然后將體外培養(yǎng)的HUVEC分為空白對(duì)照組、1.5MAC七氟醚組、10ng/ml TNF-α組以及10ng/ml TNF-α+0.5MAC、1.5MAC或2.5MAC七氟醚預(yù)處理組，分別檢測(cè)七氟醚對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HUVEC表達(dá)粘附分子及中性粒細(xì)胞粘附的影響。(2)應(yīng)用核漿分離技術(shù)和Western

4、 blot方法，觀察10 ng/mlTNF-α刺激對(duì)HUVEC的IκBα、p-IκBα、核漿＼胞漿內(nèi)NF-κB/p65亞基蛋白水平的影響及其時(shí)間趨勢(shì)；將體外培養(yǎng)的HUVEC分為空白對(duì)照組、1.5MAC七氟醚單獨(dú)刺激組、10ng/ml TNF-α單獨(dú)刺激組以及1.5MAC七氟醚預(yù)處理組，檢測(cè)各組細(xì)胞IκB-α、p-IκB-α以及核漿＼胞漿內(nèi)NF-κB/P65亞基蛋白在各自變化高峰時(shí)點(diǎn)的水平。(3)分別以0、0.5MAC、1.5MAC和2.

5、5MAC七氟醚預(yù)處理體外培養(yǎng)的HUVEC，應(yīng)用western blot法檢測(cè)p-eNOS和eNOS的蛋白水平，Griess reagent法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中總NO含量，DAF-FM DA熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)的NO含量；將體外培養(yǎng)的HUVEC分為10ng/ml TNF-α單獨(dú)刺激組、1.5MAC七氟醚+10ng/ml TNF-α刺激組、eNOS抑制劑L-NAME組，并檢測(cè)各相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中總NO含量、細(xì)胞內(nèi)NO含量以及p-e

6、NOS＼eNOS、 IκB-\p-IκB-α、核漿＼胞漿內(nèi)NF-κB/P65蛋白水平以及ICAM-1\VCAM-1的蛋白、mRNA水平和中性粒細(xì)胞與m5VEC的粘附率，確定eNOS-NO信號(hào)系統(tǒng)是否介導(dǎo)了七氟醚預(yù)處理在血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎作用。
　　 結(jié)果：(1)改良的HUVEC的體外培養(yǎng)方法是成功的，經(jīng)相差顯微鏡觀察以及Ⅷ因子染色證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞(97.5％)為HUVEC，10ng/ml的TNF-α處理HUVEC后，VCAM-1、

7、ICAM-1在4h明顯升高，之后穩(wěn)定表達(dá)，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示95％以上細(xì)胞存活良好，TNF-α誘導(dǎo)HUVEC穩(wěn)定表達(dá)粘附分子的最佳作用濃度為10ng/ml，時(shí)間為4h。與TNF-α單獨(dú)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞比較，1.5、2.5MAC七氟醚預(yù)處理明顯降低TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達(dá)水平，并降低了中性粒細(xì)胞粘附率(P<0.05)。(2)10 n/gml TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，IκBα發(fā)生降解，同時(shí)磷酸化

8、水平上調(diào)，隨之p65亞基向核內(nèi)移位，IκBα降解及磷酸化水平上調(diào)的時(shí)間高峰為30分鐘，p65亞基入核的高峰時(shí)間為60分鐘(P<0.01)；在各檢測(cè)指標(biāo)變化的高峰時(shí)點(diǎn)，與空白對(duì)照組比較，1.5MAC七氟醚單獨(dú)刺激組細(xì)胞的IκBα蛋白降解、p-IκBα蛋白水平以及NF-κB/p65蛋白亞基的入核沒(méi)有顯著變化，而1.5MAC七氟醚預(yù)處理組IκBα蛋白降解、p-IκBα蛋白水平以及NF-κB/p65蛋白亞基的入核較TNF-α單獨(dú)刺激組的有明顯抑

9、制(P<0.05)。(3)與空白對(duì)照組比較，1.5MAC和2.5MAC七氟醚預(yù)處理組的p-eNOS的表達(dá)明顯增加，且p-eNOS/eNOS比值有顯著性增高(P<0.05)，且細(xì)胞培養(yǎng)上清液中總NO含量顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)NO含量有明顯增加；與七氟醚預(yù)處理組比較，L-NAME組的細(xì)胞內(nèi)p-eNOS/eNOS、NO含量及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中總NO含量明顯下降(P<0.05)，同時(shí)，細(xì)胞的IκBα蛋白降解、p—IκBα蛋白表達(dá)水平以及

10、NF-κB/p65蛋白亞基的入核、ICAM-1＼VCAM-1的蛋白及mRNA水平和中性粒細(xì)胞粘附率均有顯著性增加(P<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)七氟醚預(yù)處理抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)及與中性粒細(xì)胞的粘附；(2)七氟醚預(yù)處理下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路激活，這可能介導(dǎo)了七氟醚預(yù)處理在TNF-α導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的抗炎作用；(3)七氟醚預(yù)處理促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS磷酸化和隨后的NO