PKA-CREB信號(hào)上調(diào)線粒體氧化磷酸化蛋白防止足細(xì)胞凋亡.pdf

1、背景：腎小球血管上皮細(xì)胞（足細(xì)胞）是終末分化的細(xì)胞，大量的足突是足細(xì)胞的標(biāo)志。兩個(gè)相鄰足細(xì)胞足突之間形成的裂隙膜是血漿蛋白濾出的關(guān)鍵分子屏障。足細(xì)胞數(shù)量減少，足突融合或裂隙膜蛋白表達(dá)減少都是大量蛋白尿發(fā)生的細(xì)胞分子學(xué)基礎(chǔ)。因此，足細(xì)胞受損后足細(xì)胞凋亡與壞死是腎小球疾病啟動(dòng)和進(jìn)展的關(guān)鍵因素。我們前期的體外研究顯示激活足細(xì)胞代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor，mGluR）1/5后，可以通過(guò)環(huán)磷酸

2、腺苷（cyclic AMP，cAMP）信號(hào)依賴的方式防止氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside，PAN）誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶A（PKA）信號(hào)介導(dǎo)了cAMP保護(hù)足細(xì)胞的作用，但是還不清楚激活PKA信號(hào)后下游信號(hào)保護(hù)足細(xì)胞的具體機(jī)制。經(jīng)典的PKA信號(hào)通過(guò)其下游的轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB）調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)

3、錄發(fā)揮其生物學(xué)作用。另外我們以前的工作發(fā)現(xiàn)PKA信號(hào)通過(guò)防止線粒體分裂從而保護(hù)足細(xì)胞，線粒體的主要功能是通過(guò)氧化磷酸化為組織細(xì)胞提供能量，PKA信號(hào)是否影響足細(xì)胞線粒體氧化磷酸化和三磷酸腺苷（ATP）產(chǎn)生也不清楚。
　　目的：探討轉(zhuǎn)錄因子CREB在cAMP/PKA信號(hào)保護(hù)足細(xì)胞中的作用，以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化磷酸化的影響。
　　方法：我們使用條件永恒的小鼠足細(xì)胞株5P12，15-25代分化的足細(xì)胞進(jìn)行研究。Cell Coun

4、ting Kit-8方法檢測(cè)細(xì)胞毒性，Annexin V/PI染色與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)足細(xì)胞凋亡，免疫熒光檢測(cè) p-CREB的表達(dá)。RNA干擾技術(shù)抑制足細(xì)胞內(nèi)CREB表達(dá)，應(yīng)用Agilent表達(dá)譜芯片檢測(cè)小鼠足細(xì)胞全基因組mRNA的表達(dá)情況。Real-time PCR檢測(cè)線粒體基因編碼的呼吸鏈復(fù)合體基因的表達(dá)。熒光素酶化學(xué)發(fā)光檢測(cè)足細(xì)胞內(nèi)ATP的水平。Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　結(jié)果：PKA特異性激動(dòng)劑pCPT-cA

5、MP分別刺激5min、15min可使足細(xì)胞總蛋白中磷酸化CREB（p-CREB）表達(dá)上升105.64±38.21％，98.61±41.03%（p<0.05），細(xì)胞核內(nèi)p-CREB的表達(dá)上升114.52±11.28%，118.84±14.44%，p<0.05。免疫熒光共聚焦顯微鏡顯示pCPT-cAMP主要引起細(xì)胞核內(nèi)p-CREB表達(dá)上升。我們發(fā)現(xiàn)阿霉素（ADR）可以誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，pCPT-cAMP預(yù)孵育足細(xì)胞可以防止ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)

6、被切割的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3）表達(dá)升高和足細(xì)胞的數(shù)量減少。RNA干擾（RNAi）可使得足細(xì)胞CREB蛋白表達(dá)下降為原來(lái)的25.1±2.44%。抑制 CREB表達(dá)后 pCPT-cAMP失去了保護(hù)的作用。應(yīng)用Agilent表達(dá)譜芯片檢測(cè)小鼠足細(xì)胞全基因組表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ADR刺激可使足細(xì)胞內(nèi)線粒體基因編碼的呼吸鏈復(fù)合體 I各亞基基因表達(dá)明顯下調(diào)，pCPT-cAMP預(yù)孵育可以防止ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)線粒體編碼的呼吸

7、鏈復(fù)合體I的ND1-5亞基的mRNA表達(dá)下調(diào)。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)激活cAMP/PKA可防止ADR引起的足細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體I亞基ND1/3/4蛋白的表達(dá)下降，而其他亞基蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異。pCPT-cAMP預(yù)處理可以防止ND3，而非ND1/4蛋白的降低，這種作用在抑制足細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白表達(dá)之后消失。同時(shí)，CREB siRNA也可減弱pCPT-cAMP引起的足細(xì)胞ATP產(chǎn)生增加以及過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子