PKA-CREB信號上調(diào)線粒體氧化磷酸化蛋白防止足細胞凋亡.pdf

1、背景：腎小球血管上皮細胞（足細胞）是終末分化的細胞，大量的足突是足細胞的標(biāo)志。兩個相鄰足細胞足突之間形成的裂隙膜是血漿蛋白濾出的關(guān)鍵分子屏障。足細胞數(shù)量減少，足突融合或裂隙膜蛋白表達減少都是大量蛋白尿發(fā)生的細胞分子學(xué)基礎(chǔ)。因此，足細胞受損后足細胞凋亡與壞死是腎小球疾病啟動和進展的關(guān)鍵因素。我們前期的體外研究顯示激活足細胞代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor，mGluR）1/5后，可以通過環(huán)磷酸

2、腺苷（cyclic AMP，cAMP）信號依賴的方式防止氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside，PAN）誘導(dǎo)的足細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶A（PKA）信號介導(dǎo)了cAMP保護足細胞的作用，但是還不清楚激活PKA信號后下游信號保護足細胞的具體機制。經(jīng)典的PKA信號通過其下游的轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB）調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)

3、錄發(fā)揮其生物學(xué)作用。另外我們以前的工作發(fā)現(xiàn)PKA信號通過防止線粒體分裂從而保護足細胞，線粒體的主要功能是通過氧化磷酸化為組織細胞提供能量，PKA信號是否影響足細胞線粒體氧化磷酸化和三磷酸腺苷（ATP）產(chǎn)生也不清楚。
　　目的：探討轉(zhuǎn)錄因子CREB在cAMP/PKA信號保護足細胞中的作用，以及對細胞內(nèi)線粒體氧化磷酸化的影響。
　　方法：我們使用條件永恒的小鼠足細胞株5P12，15-25代分化的足細胞進行研究。Cell Coun

4、ting Kit-8方法檢測細胞毒性，Annexin V/PI染色與流式細胞術(shù)檢測足細胞凋亡，免疫熒光檢測 p-CREB的表達。RNA干擾技術(shù)抑制足細胞內(nèi)CREB表達，應(yīng)用Agilent表達譜芯片檢測小鼠足細胞全基因組mRNA的表達情況。Real-time PCR檢測線粒體基因編碼的呼吸鏈復(fù)合體基因的表達。熒光素酶化學(xué)發(fā)光檢測足細胞內(nèi)ATP的水平。Western blot檢測蛋白質(zhì)表達。
　　結(jié)果：PKA特異性激動劑pCPT-cA

5、MP分別刺激5min、15min可使足細胞總蛋白中磷酸化CREB（p-CREB）表達上升105.64±38.21％，98.61±41.03%（p<0.05），細胞核內(nèi)p-CREB的表達上升114.52±11.28%，118.84±14.44%，p<0.05。免疫熒光共聚焦顯微鏡顯示pCPT-cAMP主要引起細胞核內(nèi)p-CREB表達上升。我們發(fā)現(xiàn)阿霉素（ADR）可以誘導(dǎo)足細胞凋亡，pCPT-cAMP預(yù)孵育足細胞可以防止ADR誘導(dǎo)的足細胞內(nèi)

6、被切割的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3）表達升高和足細胞的數(shù)量減少。RNA干擾（RNAi）可使得足細胞CREB蛋白表達下降為原來的25.1±2.44%。抑制 CREB表達后 pCPT-cAMP失去了保護的作用。應(yīng)用Agilent表達譜芯片檢測小鼠足細胞全基因組表達發(fā)現(xiàn)，ADR刺激可使足細胞內(nèi)線粒體基因編碼的呼吸鏈復(fù)合體 I各亞基基因表達明顯下調(diào)，pCPT-cAMP預(yù)孵育可以防止ADR誘導(dǎo)的足細胞內(nèi)線粒體編碼的呼吸

7、鏈復(fù)合體I的ND1-5亞基的mRNA表達下調(diào)。Western blot實驗證實激活cAMP/PKA可防止ADR引起的足細胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體I亞基ND1/3/4蛋白的表達下降，而其他亞基蛋白的表達無明顯差異。pCPT-cAMP預(yù)處理可以防止ND3，而非ND1/4蛋白的降低，這種作用在抑制足細胞內(nèi)CREB蛋白表達之后消失。同時，CREB siRNA也可減弱pCPT-cAMP引起的足細胞ATP產(chǎn)生增加以及過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子