艾灸對AA大鼠“足三里”穴位局部與氧化磷酸化相關(guān)基因表達的影響.pdf

1、目的:
　　采用全基因表達譜芯片和生物信息學(xué)分析技術(shù)，挖掘氧化磷酸化信號通路對艾灸刺激響應(yīng)的潛在分子靶點，運用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對潛在分子靶點進行生物學(xué)驗證，從氧化磷酸化的角度為穴位局部對艾灸刺激響應(yīng)的研究提供線索。
　　方法：
　?。?）艾灸后―足三里穴位局部氧化磷酸化信號通路及相關(guān)基因挖掘：將24只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、溫和灸組、隔附灸組。模型組、溫和灸組、隔附灸組大鼠分別給予局部注射弗氏完全佐劑

2、誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，造模后第7天，溫和灸組在―足三里穴給予溫和灸15分鐘，隔附灸組在―足三里‖穴給予隔附灸5壯。灸后2個小時，立即取各組大鼠―足三里‖穴位局部組織，提取并純化組織總RNA，用改良的cRNA反轉(zhuǎn)錄線性擴增法對實驗樣品和共同參照樣品進行熒光標(biāo)記，用27k大鼠全基因表達譜芯片進行雜交掃描，檢測―足三里穴位局部對艾灸刺激響應(yīng)的基因表達譜，用微陣列顯著性檢驗軟件（SAM）分別篩選溫和灸組、隔附灸組相對于模型組的差異基因表達譜，運

3、用隨機方差模型篩選共表達差異基因，用分子功能注釋系統(tǒng)（MAS）對共表達差異基因進行信號通路分析和相關(guān)基因挖掘。（2）生物學(xué)重復(fù)驗證實驗：以SD大鼠為研究對象，動物實驗的方法和操作完全和表達譜芯片實驗的一致，提取組織總RNA后，用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對艾灸后佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠“足三里”穴位局部氧化磷酸化信號通路的潛在分子靶點進行驗證。
　　結(jié)果：
　　1.溫和灸后―足三里‖穴位局部差異表達基因共篩選出498個，上調(diào)基因25

4、5個，下調(diào)基因243個。隔附灸后―足三里‖穴位局部差異表達基因共篩選出937個，上調(diào)基因335個，下調(diào)基因602個。―足三里‖穴位局部對溫和灸和隔附灸刺激響應(yīng)的共表達差異基因篩選出106個，上調(diào)基因44個，下調(diào)基因62個。篩選出共表達差異基因富集的信號通路27個（P＜0.001）,其中氧化磷酸化信號通路中的參與基因分別是Cox7a2、Atp6v0d2、Atp5j。（以foldchange≥2.0&|Score(d)≥2和foldchan

5、ge≤0.5&|Score(d)|≥2分別作為上調(diào)基因和下調(diào)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)）。
　　2.生物學(xué)重復(fù)驗證實驗結(jié)果：Cox7a2、Atp6v0d2、Atp5j的表達水平：模型組與空白組相比，三個基因均顯著下調(diào)（P＜0.05）；溫和灸組與模型組相比，三個基因均顯著上調(diào)（P＜0.05），與芯片結(jié)果一致；隔附灸組與模型組相比，三個基因均顯著上調(diào)（P＜0.05），與芯片結(jié)果一致；與溫和灸相比，隔附灸對三個基因的上調(diào)作用更明顯（P＜0.05），