足三里穴位局部針刺、艾灸差異響應分子特征.pdf

1、目的：
　　采用全基因表達芯片結合生物信息學技術，分別構建“足三里”穴位局部對針刺和艾灸兩種不同刺激方法響應的差異基因表達譜和分子調控網絡，挖掘“足三里”穴位局部對不同刺激的分子響應共性和差異性特征及關鍵調控靶點，從穴位局部分子響應切入，揭示針刺、艾灸后穴位局部響應的分子事件及其特征，為回答穴位局部在針刺、艾灸刺激后分子水平作用原理提供實驗依據，并為進一步篩選針刺與艾灸作用的分子靶點奠定基礎。
　　方法：
　　24只S

2、D大鼠隨機分為空白組、模型組、模型+針刺組（簡稱模針組）、模型+艾灸組（簡稱模灸組），注射弗氏完全佐劑（0.1ml）誘導佐劑性關節(jié)炎模型。模針組“足三里”穴位處予針刺15分鐘，模灸組施以溫和灸15分鐘后，立即取各組大鼠“足三里”穴位局部組織，采用Trizol法提取出樣品組織總RNA，對樣品和共同參照樣品用改良的cRNA反轉錄線性擴增法進行熒光標記，27K大鼠全基因表達譜芯片進行雜交掃描，檢測出“足三里”穴位局部全基因表達譜，采用SAM軟

3、件，以Foldchange≥2或≤0.5，且∣Score(d)∣≥2為標準篩選差異表達基因，分別構建“足三里”穴位局部對針刺、艾灸響應的差異基因表達譜，運用GO和KEGG數據庫對各組差異基因進行生物過程、分子功能和信號通路的富集度分析。采用STEM軟件對差異基因進STC趨勢分析，挖掘“足三里”穴位局部對針刺、艾灸響應的共同表達、特異表達差異基因，運用boolean函數算法對進行Dynamic-GeneNet基因調控網絡構建，并運用Cyt

4、oscape和String軟件對共同表達、特異表達差異基因及其所編碼的蛋白進行蛋白相互作用網絡的構建。
　　結果：
　　1.差異表達基因篩選結果
　　①模型組（模型組 VS空白組），“足三里”穴位局部的差異表達基因411個，其中上調287個，下調124個。②針刺后（模針組VS模型組），“足三里”穴位局部的差異表達基因693個，其中上調313個，下調380個。③模灸組（模灸組VS模型組），“足三里”穴位局部的差異表達基因

5、498個，其中上調255個，下調243個。④針刺、艾灸后，“足三里”穴位局部響應的共表達差異基因30個，42個針刺刺激特異響應基因，82個艾灸刺激特異響應基因。
　　2.差異表達基因GO富集度分析結果：
　　對針刺響應的上調的差異表達基因顯著富集的生物學過程有39個(p＜0.001)，主要富集于細胞凋亡正調節(jié)、程序性細胞死亡正調節(jié)、有機循環(huán)物質應答、細胞死亡正調節(jié)、細胞循環(huán)過程等；顯著富集的分子功能有14個(p＜0.001)

6、，主要富集于Rho GTP酶催化劑活性、相同蛋白結合、脫氨酶活性、蛋白二聚作用活性、核染質結合等。下調的差異表達基因顯著富集的生物學過程有34個(p＜0.001)，主要富集于翻譯延伸、炎癥應答、細胞自動調節(jié)、防御反應、細胞死亡等；顯著富集的分子功能有17個(p＜0.001)，主要富集于翻譯延伸因子活性、酶抑制劑活性、肽酶抑制劑活性、模式結合、多糖結合等。
　　對艾灸響應的上調的差異表達基因顯著富集的生物學過程有26個(p＜0.00

7、1)，主要富集于細胞周期、無機物質應答、有機物質應答、細胞循環(huán)過程、藥物應答等；顯著富集的分子功能有14個(p＜0.001)，主要富集于金屬離子結合，陽離子結合、離子結合、鈣離子結合、蛋白質結合域結合等。下調的差異表達基因顯著富集的生物學過程有36個(p＜0.001)，主要富集于免疫應答、防御應答、損傷應答、炎癥應答、免疫系統(tǒng)過程正調節(jié)等；顯著富集的分子功能有19個(p＜0.001)，主要富集于酶結合、細胞因子活性、多糖結合、模式結合、

8、糖類結合等。
　　3.差異表達基因的信號通路（Pathway）富集度分析結果
　　對針刺響應的差異表達基因富集于24個pathway（p＜0.05），按Pvalue排序靠前的有：自然殺傷細胞介導的細胞毒性、腎素血管緊張素系統(tǒng)、肌動蛋白細胞調節(jié)骨架、P53信號通路、血管平滑肌收縮等。
　　對艾灸響應的差異表達基因富集于34個pathway（p＜0.05），按Pvalue排序靠前的有：補體及凝血級聯反應、自然殺傷細胞介導的

9、細胞毒性、細胞粘附分子、抗原加工與遞呈、T細胞受體信號通路等。
　　4.Dynamic-GeneNet基因調控網絡構建結果：
　　共表達差異基因調控網絡中，Pla2g2a、Prg4、Aph1b、Mgl1、Serpinb1a等是關鍵節(jié)點；對針刺特異響應基因調控網絡中，Jph2、Agt、Casq2、Rhoj、Trf等是關鍵節(jié)點；對艾灸特異響應基因調控網絡中，Tnnt2、Lsp1、C1r、Clec4a1、Apobec1等是關鍵節(jié)點

10、。
　　5.蛋白相互作用網絡構建結果：
　　共表達差異基因所編碼蛋白相互作用網絡的關鍵節(jié)點是Ptgs2、Il4、Mmp3、Il13；42個針刺特異響應的基因所編碼的蛋白相互作用網絡的關鍵節(jié)點是Serpina1、Ren、Igfbp2、Igfbp3、Plg、Ace；艾灸特異響應的基因所編碼的蛋白相互作用網絡的關鍵節(jié)點是 Serpine1、Timp1、Aurkb、C1r、C1s、Ccl7、Col1a1、Laptm5、Mmp10、N

11、edd4、Nfkbia。
　　結論：
　　1.“足三里”穴位局部對針刺、艾灸響應的分子共性特征為：多基因、多生物過程、多分子功能、多信號通路參與；多富集于免疫和代謝相關的信號通路。
　　2.“足三里”穴位局部對針刺、艾灸的響應的分子差異特征為：差異表達基因大部分不同；對艾灸響應的差異表達基因富集的信號通路顯著與免疫相關。
　　3.Jph2、Agt、Casq2、Rhoj、Trf等基因可能是穴位局部對針刺響應的特異性

12、關鍵調控基因；Tnnt2、Lsp1、C1r、Clec4a1、Apobec1等基因可能是穴位局部對艾灸響應的特異性關鍵調控基因；Pla2g2a、Prg4、Aph1b、Mgl1、Serpinb1a等基因可能是穴位局部對針刺和艾灸響應的共同關鍵調控基因。
　　4.Serpina1、Ren、Igfbp2、Igfbp3、Plg、Ace可能是穴位局部對針刺響應的特異性關鍵調控蛋白；Serpine1、Timp1、Aurkb、C1r、C1s、Cc