新生隱球菌對(duì)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞氧化磷酸化作用及凋亡的影響.pdf

1、新生隱球菌(C.neoformans)是臨床上常見的條件致病真菌，具有明顯的嗜神經(jīng)傾向，主要引起免疫抑制人群的新生隱球菌性腦膜炎及腦膜腦炎，而我國(guó)感染人群主要以免疫正常者為主。新生隱球菌外層有莢膜包裹，根據(jù)莢膜多糖凝集實(shí)驗(yàn)可分為4種主要的血清型，其中，我國(guó)大陸地區(qū)主要以A血清型為主。
　　 免疫吞噬細(xì)胞在新生隱球菌感染與發(fā)病過程中有著重要的作用，小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，在新生隱球菌進(jìn)入宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)后發(fā)揮重要的免

2、疫防御作用。在INF-γ存在的情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面MHC-Ⅱ分子表達(dá)增強(qiáng)，提高對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)新生隱球菌感染的免疫力。然而，在缺乏細(xì)胞因子刺激的情況下，則C.neoformans可在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存活并繁殖，最終引起小膠質(zhì)細(xì)胞的破裂。
　　 能量代謝是宿主細(xì)胞賴以生存的重要生化過程，在維持細(xì)胞各項(xiàng)活動(dòng)中有著重要的作用。研究顯示，眾多的病原體感染宿主細(xì)胞后導(dǎo)致宿主細(xì)胞能量代謝水平受到影響，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞的凋亡或壞死。氧化磷酸化(O

3、XPHOS)系統(tǒng)嵌入在線粒體膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)膜部分，是細(xì)胞能源生產(chǎn)的最終生化途徑。許多的研究顯示，病原體感染宿主細(xì)胞后，對(duì)宿主能量代謝的影響主要表現(xiàn)在對(duì)氧化磷酸化作用的抑制作用。因此，氧化磷酸化作用在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞活性功能中發(fā)揮著重要的作用。
　　 線粒體作為能量代謝的器官，不僅為宿主細(xì)胞活動(dòng)提供能量，同時(shí)也是凋亡過程的樞紐環(huán)節(jié)，因此線粒體途徑在誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡過程中有著非常重要的作用。
　　 有關(guān)新生隱球菌引起的腦

4、膜炎動(dòng)物模型的研究表明壞死并不是新生隱球菌肉芽腫的特性，炎癥器官中炎癥細(xì)胞經(jīng)歷凋亡才是主要機(jī)制。同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)無莢膜或小莢膜的新生隱球菌的吞噬作用比野生株強(qiáng)，說明新生隱球菌的莢膜具有抗吞噬作用，提示莢膜可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)抗吞噬作用。本課題組通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無莢膜隱球菌CAP64也可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，這提示除莢膜外新生隱球菌的其他毒性因子也可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，但是具體的機(jī)制尚不明確。
　　 我們認(rèn)為在新生隱球菌感

5、染小膠質(zhì)細(xì)胞后，新生隱球菌通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞的氧化磷酸化水平而對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性產(chǎn)生作用，甚至進(jìn)一步通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用了A血清型新生隱球菌野生株H99以及同基因型的莢膜突變株CAP64為研究對(duì)象，主要對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞感染新生隱球菌后氧化磷酸化水平的改變及凋亡機(jī)制進(jìn)行探索。
　　 本研究主要分為以下四個(gè)部分:
　　 第一部分新生隱球菌GXM對(duì)BV-2細(xì)胞氧化磷酸化作用及其凋亡的影響GXM是新生隱球

6、菌莢膜多糖中最為重要的毒力因子，一直以來被認(rèn)為是對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生重要調(diào)節(jié)作用的免疫成分。本部分研究在獲得純化的GXM的基礎(chǔ)上，觀察GXM對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞氧化磷酸化水平和凋亡的影響。采用CCK-8法檢測(cè)GXM體外對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活性的抑制作用。進(jìn)行GXM體外誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用TNF-α和IFN-γ預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞，模擬炎癥條件下進(jìn)行GXM對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的干預(yù)作用，并采用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率

7、。采用超微量ATP含量測(cè)試盒檢測(cè)，根據(jù)公式（ATP濃度（umol/gprpt）=（測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(1×103umol/ml)×樣品前稀釋倍數(shù)÷待測(cè)樣本蛋白濃度(gprot/l))計(jì)算GXM干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞ATP含量。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GXM(50ug/ml)體外可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性和氧化磷酸化水平，GXM干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)ATP水平較對(duì)照組下降（P＜0.05），流式細(xì)

8、胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GXM獨(dú)立作用于小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)并不能明顯引起小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率的改變，但在IFN-γ的協(xié)同作用下可以明顯提高神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡率，而TNF-α并無此作用。提示在新生隱球菌感染宿主細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞因子中IFN-γ在對(duì)新生隱球菌產(chǎn)生殺傷作用的同時(shí)，對(duì)于宿主細(xì)胞的本身也可能造成一定的損傷。
　　 第二部分新生隱球菌對(duì)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞氧化磷酸化作用的影響
　　 氧化磷酸化作用是宿主細(xì)胞能量代謝的最后一個(gè)環(huán)節(jié)，是產(chǎn)生維持生

9、命活動(dòng)的能量的重要步驟。大量的研究表示病原體感染之后可以影響宿主細(xì)胞的能量代謝水平。本研究通過基因芯片技術(shù)篩選出新生隱球菌作用小膠質(zhì)細(xì)胞后氧化磷酸化通路上差異表達(dá)的基因，并通過RT-PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)復(fù)合體Ⅰ組成部分之一的NDUFA4基因以及編碼ATP合成酶的ATPase6V基因的表達(dá)水平均較對(duì)照組有所下降。后續(xù)的ATP水平檢測(cè)同樣證實(shí)了新生隱球菌對(duì)宿主細(xì)胞能量代謝作用的影響。同時(shí)，H99組和CAP64組同對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

10、（P值均＜0.05），但兩處理組間無明顯差異（P＞0.05），說明莢膜在新生隱球菌對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝的影響中并不起決定性的作用。
　　 新生隱球菌野生株與莢膜缺陷株體外均能誘導(dǎo)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，證明了除去莢膜成分以外的菌種成分也能誘導(dǎo)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。有可能是新生隱球菌的直接作用，或者是通過誘導(dǎo)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生而促進(jìn)宿主的凋亡。新生隱球菌感染神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致其氧化磷酸化過程中電子傳遞鏈的損傷從而影響

11、氧化磷酸化水平而使得產(chǎn)能量代謝水平下降。能量代謝水平下降必然會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的免疫活性功能下降。說明，通過影響宿主細(xì)胞能量代謝也是新生隱球菌引起宿主致病或者逃避宿主免疫殺傷的一個(gè)可能機(jī)制。
　　 第三部分新生隱球菌體外誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究
　　 誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡是病原體逃避宿主免疫殺傷或?qū)λ拗骷?xì)胞造成損傷的重要機(jī)制之一，新生隱球菌同樣具有這樣的能力。依據(jù)第二部分的研究結(jié)果，我們推測(cè)線粒體在新生隱球菌誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡

12、過程中有著重要的作用。
　　 采用Western-blot的方法檢測(cè)新生隱球菌干預(yù)宿主細(xì)胞后線粒體凋亡途徑通路上重要蛋白表達(dá)水平的差異，其中主要包括:Cyt C的釋放，Caspase3、 Caspase9、凋亡抑制蛋白Bcl-2以及凋亡促進(jìn)蛋白Bax。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)新生隱球菌感染小膠質(zhì)細(xì)胞后，小膠質(zhì)細(xì)胞Cyt c線粒體內(nèi)表達(dá)水平較對(duì)照組下降，胞漿內(nèi)表達(dá)水平上升，提示新生隱球菌可作為凋亡因素促使宿主細(xì)胞線粒體內(nèi)的Cyt c釋放入胞，而

13、進(jìn)一步引起下游的凋亡程序的啟動(dòng)，使得凋亡蛋白表達(dá)水平上升，而凋亡抑制蛋白的表達(dá)水平下降，提示線粒體凋亡途徑在新生隱球菌誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡過程中有著重要的作用。
　　 第四部分新生隱球菌性腦膜炎動(dòng)物模型中炎癥腦組織細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究
　　 采用滴鼻吸入的方式通過呼吸道構(gòu)建小鼠新生隱球菌性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染模型，利用組織病理和感染組織勻漿涂片的方法檢測(cè)模型構(gòu)建成功與否。Western-blot技術(shù)檢測(cè)新生隱球菌感染后宿主腦組織

14、炎癥細(xì)胞CytC釋放情況，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組胞質(zhì)內(nèi)Cyt C表達(dá)水平較對(duì)照組提高，線粒體內(nèi)Cyt表達(dá)水平較對(duì)照組下降;同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Caspase3、9和Bax的表達(dá)水平均較對(duì)照組提高，而Bcl-2表達(dá)水平較對(duì)照組下降。成功構(gòu)建小鼠新生隱球菌腦膜炎吸入模型，為模擬新生隱球菌自然感染狀態(tài)提供動(dòng)物研究模型。
　　 Western-blot技術(shù)檢測(cè)新生隱球菌感染后宿主腦組織炎癥細(xì)胞CytC釋放情況，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組胞質(zhì)內(nèi)Cyt C表達(dá)水平較對(duì)照組提高

15、，線粒體內(nèi)Cyt表達(dá)水平較對(duì)照組下降;同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Caspase3、9和Bax的表達(dá)水平均較對(duì)照組提高，而Bcl-2表達(dá)水平較對(duì)照組下降。
　　 結(jié)合第三部分的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示新生隱球菌可通過線粒體途徑誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡。
　　 總結(jié):
　　 1.GXM作為新生隱球菌莢膜的重要的成分，體外對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性存在明顯的抑制作用，但獨(dú)立作用于小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，并不能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡率的增加。在炎癥因子IFN-γ的協(xié)同