新生隱球菌與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用中差異表達(dá)蛋白質(zhì)的研究.pdf

1、新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CentralNervousSystem，CNS)，隱球菌性腦膜炎或腦膜腦炎是最常見(jiàn)的臨床形式。目前新生隱球菌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的之間的關(guān)系還不是十分清楚。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗原遞呈細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，對(duì)新生隱球菌具有吞噬、殺菌、抗原提呈等作用；而新生隱球菌自身的的毒性因子，可以起到幫助其逃避吞噬等作用，從而在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)寄生繁殖再感染;二者之間相互作用的過(guò)

2、程中，一些相關(guān)蛋白的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，直接研究這些蛋白的變化有助于直觀了解新生隱球菌在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病機(jī)理。蛋白質(zhì)組學(xué)研究己成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)，其技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)使直接大規(guī)模研究蛋白質(zhì)組成為可能。該課題應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)(二維電泳和質(zhì)譜分析)研究了新生隱球菌和小膠質(zhì)細(xì)胞作用前后的蛋白質(zhì)組變化，為新生隱球菌性腦膜炎的致病機(jī)理研究打下基礎(chǔ)。 該課題共分三部分：第一、二部分研究新生隱球菌和小膠質(zhì)細(xì)胞作用前后表達(dá)有差異的蛋白

3、質(zhì)，第三部分研究無(wú)莢膜新生隱球菌對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。 目的 第一部分研究鼠小膠質(zhì)細(xì)胞N9和新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株32609作用前后小膠質(zhì)細(xì)胞有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。 第二部分研究新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株32609被鼠小膠質(zhì)細(xì)胞N9吞噬前后新生隱球菌有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。 第三部分分析無(wú)莢膜新生隱球菌CAP64對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞N9的凋亡影響。 方法 第一部分將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N9細(xì)胞與新生隱球菌32609按細(xì)胞：菌

4、=1：10共孵育72小時(shí)，然后收集和提取N9細(xì)胞蛋白質(zhì)做為實(shí)驗(yàn)組，未作用的N9細(xì)胞蛋白質(zhì)做對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別做二維雙向電泳，找出差異蛋白點(diǎn)做質(zhì)譜分析，經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)功能文獻(xiàn)分析。 第二邵分將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小膠質(zhì)細(xì)胞與新生隱球菌32609共孵育，提取收集被N9吞噬的新生隱球菌的蛋白質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)組，提取單獨(dú)培養(yǎng)新生隱球菌的蛋白質(zhì)作為對(duì)照組，兩組做二維雙向電泳，差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)做質(zhì)譜分析，經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)，

5、蛋白質(zhì)功能文獻(xiàn)分析。 第三部分將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N9細(xì)胞分別與無(wú)莢膜新生隱球菌CAP64、滅活的無(wú)莢膜新生隱球菌CAP64共孵育，設(shè)定為實(shí)驗(yàn)組和滅活組；未孵育的小膠質(zhì)N9細(xì)胞為對(duì)照組，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)5個(gè)不同時(shí)段(2h、4h、8h、16h、24h)N9細(xì)胞的凋亡指數(shù)。 結(jié)果 第一部分得到了N9細(xì)胞的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的二維電泳圖，經(jīng)二維圖像分析軟件分析，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別檢測(cè)出701個(gè)蛋白點(diǎn)和980個(gè)蛋白點(diǎn)，N9細(xì)胞經(jīng)過(guò)

6、與新生隱球菌孵育后的蛋白質(zhì)組表達(dá)有增加趨勢(shì)。鑒定出了下列10個(gè)蛋白質(zhì)：Aldosereductase(AR)，Anillin，Pericentrin2,NucleosidediphosphatekinaseA(NDPKA)，Rho/Racguaninenucleotideexchangefactor2,RhoGDP-dissociationinhibitor2，GMP-PDEbeta，Selenium-bindingprotein2，F(xiàn)

7、erritinlightchain1，Activinbeta-Achain。 第二部分建立起新生隱球菌被小膠質(zhì)細(xì)胞N9吞噬模型，觀察到新生隱球菌32609被N9細(xì)胞吞噬。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別檢測(cè)出647個(gè)蛋白點(diǎn)和561個(gè)蛋白點(diǎn)，新生隱球菌被吞噬后蛋白質(zhì)組表達(dá)有所減少。該文選取了其中10個(gè)差異蛋白點(diǎn)，鑒定出了下列5個(gè)蛋白質(zhì)：Flavohemoprotein，Mitochondrialinnermembraneproteasesubu

8、nit1，DNA-damageinducibleproteinDIN7，Sisterchromatidcohesionprotein，Histonetranscriptionregulator1。 第三部分小膠質(zhì)細(xì)胞N9與無(wú)莢膜新生隱球菌CAP64孵育后，5個(gè)不同時(shí)段(2h、4h、8h、16h、24h)N9細(xì)胞的平均凋亡指數(shù)分別為9.33％、12.93％、15.37％、16.30％、20.5％分別與空白組平均凋亡指數(shù)(1.33％

9、，3.03％，3.23％，5.03％，6.87％)，滅活組平均凋亡指數(shù)(0.8％，1.7％，3.5％，3.7％，5.40％)有顯著差異(P＜0.05)。 結(jié)論 第一部分這10個(gè)鑒定出的蛋白質(zhì)涉及小膠質(zhì)細(xì)胞N9的糖代謝、細(xì)胞骨架、信號(hào)傳導(dǎo)，金屬和微量元素四個(gè)方面。醛糖還原酶(AldosereductaseAR)涉及糖代謝多元醇的通路，AR表達(dá)上調(diào)，會(huì)導(dǎo)致山梨醇在細(xì)胞內(nèi)堆積，進(jìn)而會(huì)產(chǎn)生滲透性損傷，第一次揭示臨床上新生隱球菌性

10、腦膜炎表現(xiàn)的高顱壓與細(xì)胞內(nèi)水腫有關(guān)。Anillin，Pericentrin2，NDPKA和細(xì)胞骨架有關(guān)：Anillin是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其調(diào)節(jié)著肌動(dòng)蛋白絲的運(yùn)動(dòng)。Pericentrin2則和細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)微管開(kāi)始排列有關(guān)。NDPKA則為細(xì)胞骨架的活動(dòng)提供能量。Rho/Racguaninenucleotideexchangefactor2，RhoGDP-dissociationinhibitor2，GMP-PDEbeta三

11、個(gè)蛋白和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)：新生隱球菌的配體(第一信使)特異地與細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，刺激細(xì)胞產(chǎn)生胞內(nèi)調(diào)節(jié)信息分子cGMP(第二信使)，并將信息傳遞到細(xì)胞特異的反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生病理性應(yīng)答反應(yīng)。證實(shí)新生隱球菌對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞信號(hào)可通過(guò)細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)受體通道傳導(dǎo)。Selenium-bindingprotein2是硒結(jié)合蛋白，介導(dǎo)形成硒蛋白，起到保護(hù)細(xì)胞不被氧化的作用。Ferritinlightchain1功能和鐵蛋白有關(guān)。Activinbe

12、ta-Achain具體功能不清楚，可能和神經(jīng)細(xì)胞存活有關(guān)。 第二部分首次發(fā)現(xiàn)新生隱球菌有Flavohemoprotein，該蛋白可將一氧化氮(NO)轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，從而保護(hù)其不受小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮(NO)的殺傷，該蛋白可能是一個(gè)新的毒性因子；Mitochondrialinnermembraneproteasesubunit1該酶可以催化去除信號(hào)肽，表達(dá)上調(diào)提示進(jìn)入線粒體的蛋白增多，提示新生隱球菌被吞噬后可能所需的能量合成增加

13、；DNA-damageinducibleproteinDIN7和DNA修復(fù)有關(guān)，提示新生隱球菌被吞噬后其DNA可能受到損傷，需要該蛋白修復(fù)，是一種自我修復(fù)機(jī)制的表現(xiàn)。Sisterchromatidcohesionprotein和Histonetranscriptionregulator1兩個(gè)蛋白具體功能尚不明確。 第三部分有活力的CAP64才能引起小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，證實(shí)莢膜不是唯一誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素，新生隱球菌其它的毒性因子在誘