MITOFILIN的缺失抑制線粒體DN的轉(zhuǎn)錄而降低氧化磷酸化的功能.pdf

1、線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)是機(jī)體的能量工廠,它為機(jī)體的生命活動(dòng)提供絕大部分的能量,該系統(tǒng)功能失常可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生,包括遺傳性線粒體疾病、衰老及相關(guān)病變。在正常生理狀態(tài)下,線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)的產(chǎn)能迅速而靈敏的變化,以應(yīng)答機(jī)體隨時(shí)變化的能量需求。氧化磷酸化系統(tǒng)是由5個(gè)復(fù)合物組成,這些復(fù)合物的組成亞基由核DNA和線粒體DNA共同編碼,其中,線粒體DNA編碼的13個(gè)亞基是線粒體復(fù)合物所必需的,因此,線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)對(duì)于氧化磷酸化適應(yīng)機(jī)體的

2、能量需求非常重要。
　　 Mitofilin是一種線粒體內(nèi)膜蛋白,為了深入研究該蛋白在氧化磷酸化中的作用,我們建立了Mitofilin敲除鼠。Southern blot和Western blot沒有檢測(cè)到Mitofilin-/-小鼠出生。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明Mitofilin-/-小鼠胚胎在胚胎期死亡。采用胚胎形態(tài)學(xué)觀察并結(jié)合RT-PCR和基因組PCR等方法,我們發(fā)現(xiàn)Mitofilin-/-胚胎死于胚胎期7.5天-10.5天之間;胚胎

3、形態(tài)學(xué)觀察顯示Mitofilin-/-胚胎生長(zhǎng)變緩,個(gè)體較雜合子和野生型小;TUNEL染色結(jié)果顯示9.5天的Mitofilin/-胚胎中大量的胚體細(xì)胞死亡,9.5天后,Mitofilin-/-胚胎死亡并被逐步吸收;對(duì)8.5天的Mitofilin-/-胚胎利用電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)線粒體大小不一,內(nèi)膜及嵴結(jié)構(gòu)紊亂;在功能學(xué)檢測(cè)方面,我們采用酶學(xué)染色實(shí)驗(yàn)方法對(duì)Mitofilin-/胚胎的氧化磷酸化功能進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合物Ⅳ活性較野生型

4、和雜合子明顯降低,而全部由核基因編碼的亞基組裝的復(fù)合物Ⅱ的活性沒有明顯改變。這些結(jié)果顯示Mitofilin-/-胚胎中氧化磷酸化系統(tǒng)功能的缺失。對(duì)于Mitofilin+/-小鼠,我們通過復(fù)合物體內(nèi)外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)、ATP供給實(shí)驗(yàn)以及mtDNA轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):有mtDNA編碼的亞基參與的復(fù)合物酶的活性明顯下降,而全部由核基因編碼的亞基組裝的復(fù)合物Ⅱ的活性沒有明顯變化,說明Mitofilin+/-小鼠中Mitoifilin的部分缺失也會(huì)導(dǎo)致

5、線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)功能失常。基于Mitofilin-/4和Mitofilin+/-鼠中有mtDNA編碼的亞基參與的復(fù)合物酶的活性明顯下降,而全部由核基因編碼的亞基組裝的復(fù)合物Ⅱ的活性沒有明顯變化這一證據(jù),我們推測(cè)Mitofilin可能是通過影響線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)氧化磷酸化系統(tǒng)。
　　 為了進(jìn)一步研究Mitofilin在線粒體DNA轉(zhuǎn)錄中的作用,我們首先通過線粒體DNA免疫共沉淀的方法明確了Mitofilin在D-loop

6、區(qū)的結(jié)合位點(diǎn),它在線粒體DNA的D-loop區(qū)的3'端有強(qiáng)的結(jié)合位點(diǎn),另外,Mitofilin也可以在線粒體DNA D-loop區(qū)的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀和GST-pulldown的實(shí)驗(yàn)方法,我們發(fā)現(xiàn),Mitofilin可與線粒體轉(zhuǎn)錄因子TFAM、TFB1M和TFB2M相互作用。通過RNA干擾實(shí)驗(yàn)、線粒體DNA免疫共沉淀和Realtime PCR實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Mitofilin的下調(diào)導(dǎo)致TFAM在線粒體DNA啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合減

7、弱;同時(shí)使線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄水平降低,而核基因編碼的亞基的RNA水平并沒有明顯改變,但是核基因編碼的亞基的蛋白含量降低,可能由于Mitofilin的干擾影響了線粒體的功能,導(dǎo)致這些核基因編碼的亞基的蛋白不能正常發(fā)揮功能而被降解?；谏鲜鲞@些實(shí)驗(yàn)證據(jù),我們提出一種假設(shè),即Mitofilin在線粒體DNA的D-loop區(qū)3'端結(jié)合后,使得該區(qū)形成一loop結(jié)構(gòu),可使結(jié)合在啟動(dòng)子區(qū)的TFAM靠近并結(jié)合在線粒體DNA的啟動(dòng)子區(qū)啟動(dòng)線粒體DNA的