炎癥反應(yīng)及PKA-CREB信號途徑介導(dǎo)帕瑞昔布腦保護(hù)機(jī)制的探討.pdf

1、腦缺血一定時(shí)間恢復(fù)血液供應(yīng)后,其功能不但未能恢復(fù),卻出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦機(jī)能障礙,稱之為腦缺血/再灌注(Ischemic-reperfusion,I/R)損傷。臨床麻醉中頸動脈瘤手術(shù)、顱內(nèi)動脈瘤切除術(shù)、心肺復(fù)蘇過程中均不可避免地發(fā)生腦缺血再灌注損傷,影響了患者術(shù)后預(yù)后,這引起了麻醉工作者的重視,如何防治腦缺血再灌注損傷已成為科研的重要內(nèi)容之一。
　　環(huán)氧化酶(Cyclcoxygenase,COX),又稱前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶,是前

2、列腺素(Prostaglandin,PG)合成過程中一個(gè)重要限速酶,催化花生四烯酸經(jīng)由PGG2轉(zhuǎn)化成PGH2。COX分為結(jié)構(gòu)型(COX-1)和誘導(dǎo)型(COX-2)。COX-1被認(rèn)為是“看家基因”,在大多數(shù)正常組織中的表達(dá)穩(wěn)定;而COX-2被認(rèn)為是“快速反應(yīng)基因”,靜息時(shí)不表達(dá),僅在細(xì)胞受到刺激時(shí)迅速合成,細(xì)菌脂多糖、生長因子、促炎細(xì)胞因子、促腫瘤劑可促進(jìn)COX-2表達(dá)增加。基于此人們推測COX-2是在炎癥和其他病理情況中的主要存在形式。

3、大量研究表明COX-2在缺血性腦損傷中至關(guān)重要。在離體實(shí)驗(yàn)以及不同腦缺血、腦出血、腦外傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?抑制COX-2可以起到一定的神經(jīng)保護(hù)保護(hù)作用。盡管2004年9月Merck公司自愿召回因長期慢性服用導(dǎo)致嚴(yán)重心血管事件的羅非考昔(商品名:萬絡(luò)),但是抑制缺血性神經(jīng)元表達(dá)COX-2、COX-2下游損傷因子仍然是令人感興趣的研究方向。諸多動物實(shí)驗(yàn)都證實(shí)短期給予COX-2抑制劑并不加重腦損傷,但是真正應(yīng)用于臨床時(shí),臨床醫(yī)師還是有所顧慮的。相對

4、于其它COX-2抑制劑,臨床上更易接受帕瑞昔布。帕瑞昔布(商品名:特耐)是第二代COX-2抑制劑,是唯一可以經(jīng)靜脈注射或肌內(nèi)注射的高選擇性COX-2抑制劑,現(xiàn)用于術(shù)后疼痛的短期治療,不良反應(yīng)少。目前研究發(fā)現(xiàn)帕瑞昔布能減輕心肌缺血性損傷,抑制心肌細(xì)胞死亡,改善心臟功能。但帕瑞昔布介導(dǎo)的腦保護(hù)機(jī)制目前仍不清楚,值得我們深入研究。越來越多的研究證據(jù)表明神經(jīng)炎癥在腦缺血損傷進(jìn)展中發(fā)揮著舉足輕重的作用。由于磷脂酶的協(xié)調(diào)作用,缺血后的膜磷脂釋放大量

5、游離的花生四烯酸,經(jīng)由COX的花生四烯酸代謝途徑在腦血管閉塞后的神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著積極作用,是各種形式腦損傷包括腦缺血中觸發(fā)和促進(jìn)炎癥進(jìn)展的重要成分。人們已經(jīng)在心肌缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)抑制高遷移率族蛋白1(High mobility group box 1 protein,HMGB1)表達(dá)可以有效發(fā)揮心肌保護(hù)作用,我們推測抑制炎癥介質(zhì)HMGB1表達(dá)有可能介導(dǎo)帕瑞昔布的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)/c

6、AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element-binding protein,CREB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是重要的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一,在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)再生、記憶功能、突觸可塑性及細(xì)胞修復(fù)中發(fā)揮著中樞性作用。自噬性程序性細(xì)胞死亡即II型程序性細(xì)胞死亡,不同于細(xì)胞凋亡,吸引了越來越多研究人員的關(guān)注。在缺血、炎癥等應(yīng)激狀態(tài)下,自噬可以被激活且與細(xì)胞死亡密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)Beclin1在心肌缺血再灌注階段的自噬現(xiàn)象中發(fā)揮著重要的作

7、用。因此,本課題選用遠(yuǎn)端大腦中動脈永久性阻斷后再阻斷雙側(cè)頸總動脈60min的缺血再灌注模型,于缺血前15min、缺血后12h經(jīng)陰莖背靜脈注射帕瑞昔布,探討炎癥反應(yīng)、PKA/CREB、自噬是否參與了其神經(jīng)保護(hù)作用。
　　本課題首先通過評估再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺陷評分、腦梗死體積百分比,觀察不同劑量的帕瑞昔布是否對Sprague-Dawley大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用;其次,第二部分通過評估再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺陷評分、腦梗死體

8、積百分比、缺血側(cè)大腦皮層神經(jīng)元HE染色及Nissl染色形態(tài)學(xué)變化、缺血半影區(qū)炎癥介質(zhì)TNF-α、HMGB1表達(dá),提示帕瑞昔布可能通過抑制炎癥反應(yīng)及炎癥介質(zhì)表達(dá)而發(fā)揮有效的神經(jīng)保護(hù)作用;隨后,第三部分給予特異性PKA抑制劑,觀察再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺陷評分、腦梗死體積百分比、缺血半影區(qū)p-CREB及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表達(dá),探討帕瑞昔布介導(dǎo)的腦保護(hù)效應(yīng)可能是激

9、活PKA/CREB途徑,增加p-CREB、BDNF的表達(dá)所致;最后,第四部分給予自噬抑制劑,觀察再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺陷評分、腦梗死體積百分比、缺血側(cè)大腦皮層神經(jīng)元Nissl染色、缺血半影區(qū)Beclinl表達(dá),推測帕瑞昔布可能通過抑制自噬:Beclin1表達(dá)而減少神經(jīng)細(xì)胞死亡,減輕腦缺血再灌注損傷。本課題研究結(jié)果證實(shí):
　　(1)靜脈注射不同劑量的帕瑞昔布均能明顯促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù),減小腦梗死體積,產(chǎn)生顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。但

10、未證實(shí)帕瑞昔布在本模型中的神經(jīng)保護(hù)作用呈劑量依賴性;
　　(2)帕瑞昔布可能通過抑制炎癥反應(yīng)及炎癥介質(zhì)表達(dá),減少缺血再灌注所致的神經(jīng)元死亡,發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用;
　　(3)帕瑞昔布可能通過激活:PKA/CREB途徑,增加p-CREB的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)BDNF表達(dá),減輕腦缺血再灌注損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;
　　(4)帕瑞昔布可能通過抑制自噬Beclin1表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),減少腦缺血再灌注造成的神經(jīng)元死亡,發(fā)揮一定

11、的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　總之,腦缺血及再灌注所致的神經(jīng)元損傷是一系列極為復(fù)雜的病理生理過程,而帕瑞昔布介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制也是一個(gè)多分子參與的多信號通路交織的復(fù)雜級聯(lián)反應(yīng)。
　　第一章不同劑量帕瑞昔布對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的:觀察靜脈注射帕瑞昔布4 mg/kg或20 mg/kg是否能發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。
　　方法:健康雄性SD大鼠,體重300～350 g,隨機(jī)分為四組:假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注組

12、(I/R)、帕瑞昔布1組(Parecoxib1)、帕瑞昔布2組(Parecoxib2)。電凝左側(cè)大腦中動脈永久性阻斷(Permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO)后再阻斷雙側(cè)頸總動脈60min,缺血前15min、缺血后12h經(jīng)陰莖背靜脈注射帕瑞昔布4 mg/kg或20 mg/kg。Sham組與I/R組注射等容積的生理鹽水。各組于麻醉5min、大腦中動脈永久性阻斷15min及再灌注15

13、min時(shí)分別記錄平均動脈壓、心率、體溫,并抽動脈血行血?dú)夥治觥Ｔ俟嘧d、3d、7d時(shí)評估神經(jīng)功能缺陷評分,再灌注3d時(shí)2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)法測定大鼠腦梗死體積百分比。
　　結(jié)果:各組pH值、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動脈血氧分壓(PaO2)、平均動脈壓(MAP)及體溫(T)差異無統(tǒng)汁學(xué)意義(P＞0.05);與I/R組相比,再灌注1d

14、、3d、7d時(shí)神經(jīng)功能缺陷評分顯示Parecoxib1組和Parecoxib2組均能明顯改善神經(jīng)功能(P＜0.05),但兩組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與I/R組相比,再灌注3d時(shí)TTC染色顯示Parecoxib1組和Parecoxib2組均能明顯減少腦梗死體積百分比(P＜0.05),但兩組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:靜脈注射不同劑量的帕瑞昔布均能明顯促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù),減小腦梗死體積,產(chǎn)生顯

15、著的神經(jīng)保護(hù)作用。但未證實(shí)帕瑞昔布在本模型中的神經(jīng)保護(hù)作用呈劑量依賴性。
　　第二章帕瑞昔布對腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的影晌
　　目的:觀察帕瑞昔布對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半影區(qū)炎癥介質(zhì)TNF-α、HMGB-1表達(dá)的影響。
　　方法:健康雄性SD大鼠,體重300～350g,隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)、帕瑞昔布組(Parecoxib)。缺血再灌注模型為pMCAO并阻斷雙側(cè)頸總動脈60m

16、in,缺血前15min、缺血后12h經(jīng)陰莖背靜脈注射帕瑞昔布4mg/kg。Sham組與I/R組注射等容積的生理鹽水。再灌注1 d、3d、7d時(shí)評估神經(jīng)功能缺陷評分、缺血側(cè)大腦皮層神經(jīng)元HE染色及Nissl染色形態(tài)學(xué)變化、缺血半影區(qū)炎癥介質(zhì)TNF-α、HMGB1表達(dá);再灌注3d時(shí)TTC法測定大鼠腦梗死體積百分比。
　　結(jié)果:與I/R組相比,再灌注1d、3d、7d時(shí),帕瑞昔布能明顯改善神經(jīng)功能、減少TNF-α陽性細(xì)胞及HMGB1的表達(dá)

17、(P＜0.05);再灌注3d時(shí),與I/R組相比,Parecoxib組能明顯減少腦梗死體積百分比(P＜0.05)。
　　結(jié)論:帕瑞昔布可能通過抑制炎癥反應(yīng)及炎癥介質(zhì)表達(dá),減少缺血再灌注所致的神經(jīng)元死亡,發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第三章PKA/CREB信號途徑在帕瑞昔布腦保護(hù)效應(yīng)中的作用
　　目的:探討PKA/CREB信號途徑在帕瑞昔布腦保護(hù)效應(yīng)中的作用。
　　方法:健康雄性SD大鼠,體重300～350g,隨機(jī)分

18、為五組:假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)、帕瑞昔布組(Parecoxib)、帕瑞昔布+H-89組(Parecoxib+H-89)、H-89組(H-89)。缺血再灌注模型為pMCAO并阻斷雙側(cè)頸總動脈60min,缺血前30min腹腔注射PKA抑制劑H-89,缺血前15min、缺血后12h經(jīng)陰莖背靜脈注射帕瑞昔布4mg/kg。再灌注1d、3d、7d時(shí)觀察神經(jīng)功能缺陷評分、缺血半影區(qū)p-CREB及BDNF的表達(dá);再灌注3d時(shí)TTC

19、法測定大鼠腦梗死體積百分比。
　　結(jié)果:與I/R組相比,再灌注1d、3d、7d時(shí),帕瑞昔布能明顯改善神經(jīng)功能、增加p-CREB及BDNF的表達(dá)(P＜0.05);再灌注3d時(shí),與I/R組相比,Parecoxib組能明顯減少腦梗死體積百分比(P＜0.05);PKA抑制劑H-89能拮抗帕瑞昔布的腦保護(hù)效應(yīng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:帕瑞昔布可能通過激活PKA/CREB途徑,增加p-CREB的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)BDNF表達(dá),減輕腦缺血

20、再灌注損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第四章帕瑞昔布對腦缺血再灌注損傷自噬的影響
　　目的:觀察帕瑞昔布對大鼠腦缺血再灌注損傷后自噬的影響。
　　方法:健康雄性SD大鼠,體重300～350g,隨機(jī)分為四組:假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)、帕瑞昔布組(Parecoxib)、3-甲基腺嘌呤組(3-MA)。缺血再灌注模型為pMCAO并阻斷雙側(cè)頸總動脈60min,缺血前15min、缺血后12h經(jīng)陰莖背靜脈注射帕瑞昔

21、布4mg/kg,3-MA組于缺血前15min側(cè)腦室給予自噬抑制劑3-MA600nmol。再灌注1d、3d、7d時(shí)觀察大鼠神經(jīng)功能缺陷評分、缺血側(cè)大腦皮層神經(jīng)元Nissl染色、缺血半影區(qū)Beclin1表達(dá);再灌注3d時(shí)TTC法測定大鼠腦梗死體積百分比。
　　結(jié)果:與I/R組相比,再灌注1d、3d、7d時(shí),帕瑞昔布、3-MA均能明顯改善神經(jīng)功能、增加存活神經(jīng)元、減少Beclin1表達(dá)(P＜0.05);再灌注3d時(shí),與I/R組相比,Pa