土三七誘導(dǎo)小鼠HVOD模型的建立及丹參對(duì)HVOD預(yù)防性治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：肝小靜脈閉塞病又稱肝竇阻塞綜合征\，臨床表現(xiàn)為肝大、腹水、體重增加和黃疸。常因骨髓移植前大劑量使用細(xì)胞毒藥物和免疫抑制劑預(yù)處理如環(huán)磷酰胺、白消胺[2,3,4]等和/或全身放療及服用含吡咯烷生物堿藥物引起。肝移植、肺移植術(shù)后亦可發(fā)生HVOD。HVOD是骨髓移植后的三大并發(fā)癥之一,發(fā)生率達(dá)10％-50％，重度死亡率達(dá)90％以上。預(yù)防和治療HVOD是移植患者預(yù)后良好的關(guān)鍵。我國(guó)栽種土三七面廣，土三七服用人群多。近年來(lái)國(guó)內(nèi)因服土三七預(yù)

2、防老年心血管疾患致肝小靜脈閉塞病的報(bào)道明顯增多。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)環(huán)磷酰胺、野百合堿作為模型對(duì)照，并與云南三七比較，利用土三七建立HVOD模型，并對(duì)該模型進(jìn)行：①小鼠一般情況觀察；②肝功能損害檢測(cè)；③病理學(xué)評(píng)分。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)利用不同劑量的丹參對(duì)土三七模型進(jìn)行干預(yù)，研究血管粘附分子相關(guān)改變，初步探討丹參對(duì)HVOD防治效果及其防治作用機(jī)制。
　　 目的：建立土三七誘導(dǎo)的肝小靜脈閉塞病模型。利用磷酸緩沖液、云南三七作為正常對(duì)照組，用環(huán)磷酰胺、

3、野百合堿、土三七三種藥物誘導(dǎo)肝小靜脈閉塞病(HVOD)模型，比較各模型的利弊，為HVOD的研究提供良好的造模方法。
　　 方法：將110只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為五組，分別予磷酸緩沖液(PBS)、云南三七、環(huán)磷酰胺、野百合堿(MCT)，、土三七灌胃，并分別在灌胃后30天、30天、30天、7天、30天處死小鼠，測(cè)肝重/體重、ALT、AST、ALB、TBIL;對(duì)肝組織進(jìn)行HE染色、Masson染色，并用修改后Deleve評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理

4、學(xué)評(píng)分。
　　 結(jié)果：
　　 1.PBS組和云南三七組無(wú)小鼠成模，環(huán)磷酰胺組、野百合堿組、土三七組分別有5只、l8只、24只成模。
　　 2.各模型組與PBS對(duì)照組比較，小鼠肝重/體重、血清ALT、AST、TBIL明顯升高，ALB明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各模型組間肝重/體重、肝功能無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 3.根據(jù)修改后Deleve評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，各模型組病理學(xué)改變符合HVOD，模

5、型組評(píng)分土三七組、環(huán)磷酰胺組成模小鼠大部分表現(xiàn)為中、重度HVOD，野百合堿組成模小鼠大部分表現(xiàn)為輕、中度。
　　 結(jié)論：環(huán)磷酰胺、土三七、野百合堿均能誘導(dǎo)HVOD模型，土三七和野百合堿組成模率較環(huán)磷酰胺高。土三七誘導(dǎo)的HVOD模型符合人類HVOD病理改變，為HVOD進(jìn)一步研究提供了新的造模方法。
　　 目的：觀察丹參對(duì)土三七誘導(dǎo)小鼠HVOD的預(yù)防治療作用。
　　 方法：將100只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為四組，分別為磷

6、酸緩沖液(PBS)組、土三七組、丹參預(yù)防治療組(分兩個(gè)劑量組：100mg/kg，200mg/kg)。各組分別連續(xù)灌胃30天，灌胃結(jié)束后處死小鼠，留取血清、肝組織。測(cè)肝重/體重、ALT、AST、ALB、TBIL；對(duì)肝組織進(jìn)行HE染色、Masson染色，并用修改后Deleve評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。用免疫組化法和RT-PCR法檢測(cè)肝組織PAI-1和VEGF表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.土三七組、丹參100mg/kg預(yù)防

7、治療組、丹參200mg/kg預(yù)防治療組分別有24只、8只、3只小鼠發(fā)生HVOD。
　　 2.丹參預(yù)防治療組與土三七模型組比較，小鼠肝重/體重、小鼠血清ALT、.AST、TBIL明顯降低，ALB明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：丹參200mg/kg預(yù)防治療組與丹參100mg/kg預(yù)防治療組比較效果好，丹參200mg/kg預(yù)防治療組小鼠肝重/體重明顯減小，小鼠血清ALT、AST、TBIL明顯降低，血清ALB明顯升高，差異有

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.各組小鼠肝臟病理評(píng)分結(jié)果：土三七組發(fā)生HVOD小鼠肝臟病理評(píng)分大部分表現(xiàn)以中、重度為主；丹參100mg/kg預(yù)防治療組HVOD小鼠多表現(xiàn)為輕、中度，僅1例為重度；丹參200mg/kg預(yù)防治療組發(fā)生HVOD小鼠多為輕度，無(wú)一例表現(xiàn)為重度。
　　 4.肝組織PAI-1及VEGF免疫組化結(jié)果：丹參預(yù)防治療組與土三七模型組比較，PAI-1和VEGF水平顯著降低(P<0.05)，丹參200m

9、g/kg預(yù)防治療組PAI-1與VEGF水平比丹參100mg/kg預(yù)防治療組下降更明顯(P<0.05)。
　　 5.肝組織RT-PCR檢測(cè)PAI-1及VEGF的mRNA結(jié)果：丹參預(yù)防治療組與土三七模型組比較，PAI-1和VEGF mRNA水平顯著降低(P<0.05)，丹參200mg/kg預(yù)防治療組PAI-1和VEGF mRNA水平比丹參100mg/kg預(yù)防治療組顯著降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.丹

10、參預(yù)防治療土三七誘導(dǎo)HVOD有效小鼠的血清ALT、AST、TBIL下降、ALB增加，減輕肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞病理?yè)p害，從而降低肝組織病理學(xué)評(píng)分。
　　 2.不同劑量丹參可減少土三七誘導(dǎo)小鼠HVOD的發(fā)生。丹參組肝臟PAI-1和VEGF水平明顯降低，HVOD發(fā)生率低，丹參200mg/kg組較丹參100mg/kg組預(yù)防治療效果顯著。丹參組小鼠肝臟PAI-1和VEGF水平降低，病情程度相對(duì)較輕，提示HVOD小鼠預(yù)后較好，肝臟PAI-1

11、和VEGF表達(dá)水平檢測(cè)可作為HVOD病情程度及預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)。
　　 目的：觀察丹參對(duì)土三七誘導(dǎo)HVOD小鼠肝臟腫瘤壞死因子a、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管細(xì)胞間粘附分子1、細(xì)胞間粘附分子1、核轉(zhuǎn)錄因子p65 mRNA和蛋白水平及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的mRNA水平，探討丹參預(yù)防HVOD的作用機(jī)制。
　　 方法：(1)每組隨機(jī)取4只小鼠肝臟行RT-PCR檢測(cè)：腫瘤壞死因子a、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)

12、因子受體1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2、血管細(xì)胞問(wèn)粘附分子1、細(xì)胞間粘附分子1、核轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)。(2)每組隨機(jī)取5只小鼠肝臟行western bloting檢測(cè)肝組織腫瘤壞死因子a、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管細(xì)胞間粘附分子1、細(xì)胞間粘附分子1、核轉(zhuǎn)錄因子p65的蛋白水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.肝組織RT-PCR檢測(cè)的mRNA結(jié)果：腫瘤壞死因子a、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2、血管細(xì)

13、胞間粘附分子1、細(xì)胞間粘附分子1、核轉(zhuǎn)錄因子p65 mRNA表達(dá)模型組比PBS組顯著升高(P<0.05)；丹參預(yù)防治療組比模型組顯著降低(P<0.05)。
　　 2.肝組織western bloting檢測(cè)蛋白結(jié)果：肝組織腫瘤壞死因子a、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管細(xì)胞間粘附分子1、細(xì)胞間粘附分子1、核轉(zhuǎn)錄因子p65蛋白表達(dá)模型組比PBS組顯著升高(P<0.05)；丹參預(yù)防治療組比模型組顯著降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：

14、
　　 1.丹參可能通過(guò)下調(diào)肝組織中TNF-a、VCAM-1、ICAM-1、NF-kBp65mRNA和蛋白表達(dá)，抑制炎性因子的表達(dá)，減少滲出，抑制血栓形成，減少HVOD發(fā)生。
　　 2.丹參可能通過(guò)下調(diào)肝組織中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)及VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA的表達(dá)，阻止肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，減少內(nèi)皮通透性，從而減少HVOD發(fā)生。
　　 \ 本研究首次運(yùn)用土三七煎液灌胃誘導(dǎo)小鼠HVOD模型，并對(duì)

15、該模型進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。用丹參預(yù)防治療土三七誘導(dǎo)的小鼠HVOD模型來(lái)觀察丹參預(yù)防性治療HVOD的效果，并初步探討丹參預(yù)防治療}tVOD發(fā)生的作用機(jī)制。本研究采用血清生化學(xué)，病理學(xué)的HE染色、Masson染色、免疫組織化學(xué)染色，RT-PCR、Western bloting等方法，從血清生化、組織、mRNA、蛋白的水平來(lái)評(píng)價(jià)丹參預(yù)防性治療HVOD的效果和探討丹參預(yù)防}tVOD發(fā)生的作用機(jī)制。結(jié)果：①土三七能誘導(dǎo)小鼠HVOD發(fā)生，成模率高，病理

16、學(xué)改變符合人類HVOD變化。②丹參具有降低小鼠血清ALT、AST、TBIL，增加ALB，減少肝竇淤血，減輕肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞變性、壞死的作用。③丹參具有降低小鼠肝臟PAI-1、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)作用，PAI-1、VEGF可作為評(píng)價(jià)HVOD預(yù)后標(biāo)志之一。④丹參具有下調(diào)小鼠肝組織中TNF-a、VCAM-1、ICAM-1、NF-KBp65 mRNA和蛋白表達(dá)，抑制炎性因子的表達(dá)，防止血栓形成，減少HVOD發(fā)生的作用。⑤丹參具有下調(diào)

17、肝組織VEGF mRNA和蛋白表達(dá)及VEGF-R1、VEGF-R2mRNA的表達(dá)的作用。結(jié)論：土三七能成功誘導(dǎo)小鼠HVOD發(fā)生。丹參對(duì)土三七誘導(dǎo)的小鼠HVOD有預(yù)防性治療作用。其作用機(jī)制可能與減少炎癥因子，降低肝組織VCAM-1、ICAM-1、NF-kBp65 mRNA和蛋白表達(dá)，預(yù)防血栓形成有關(guān)。丹參可降低VEGF mRNA和蛋白表達(dá)及VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA的表達(dá)，從而阻止肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、壞死，減少內(nèi)皮細(xì)胞間通透