視網(wǎng)膜母細胞瘤裸小鼠模型建立及誘導分化治療實驗.pdf

1、視網(wǎng)膜母細胞瘤是小兒最常見的眼部惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率有上升趨勢。視網(wǎng)膜母細胞瘤以其特有的遺傳規(guī)律，多方向分化潛力和較高的退變率，受到醫(yī)學界廣泛關注。人類腫瘤裸小鼠皮下移植模型因保留了來源腫瘤的大部分生物學特點，一直被廣泛用于腫瘤基礎研究和臨床前期實驗。 本實驗建立裸小鼠皮下視網(wǎng)膜母細胞瘤移植瘤模型，研究其生物學特性，腫瘤發(fā)生，發(fā)展機制。 目前對于視網(wǎng)膜母細胞瘤的來源，主要有兩種觀點：一種觀點認為起源于未分化的干細胞

2、，即細胞分化過程的停滯和阻斷、細胞不能分化所致；另一種觀點認為起源于成熟視網(wǎng)膜的某些功能細胞，即成熟細胞去分化所致。此外有觀點認為，維甲酸對視網(wǎng)膜母細胞瘤具有誘導分化的作用。 本實驗擬在動物模型的基礎上，以維生素A缺乏飲食和全反式維甲酸治療荷瘤鼠，探討維甲酸在視網(wǎng)膜母細胞瘤裸鼠移植瘤成瘤過程中的誘導分化作用及可能的機理。 材料及方法 將贈與的SO-RB<,50>人源性視網(wǎng)膜母細胞瘤株細胞懸浮液2×10<'6>種植

3、于鼠齡6周，體重18-20克，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)的雄性裸小鼠腋部皮下，定期觀察移植部位，待腫瘤長至直徑1-2cm時，脊椎脫臼法處死裸鼠，將移植瘤，每代6-20只不等連續(xù)傳代。 定期觀察腫瘤生長情況，記錄腫瘤生長的潛伏期和生長速度，計算生長曲線及倍增時間，光鏡觀察腫瘤結構，透射電鏡觀察超微結構，采用免疫組織化學技術-二步法檢測NSE，S-100，CHG-Al及SYN的表達。 將第四代移植瘤體積較均一的18只荷瘤鼠，接種第8周

4、時隨機分成三組：給藥組、對照組和維甲酸缺乏組。給藥組(6只)口服全反式維甲酸30mg/kg/d/只：對照組(6只)口服等體積芝麻油；維甲酸缺乏組(6只)飼以完全缺乏維甲酸的飲食。方法同第一部分，定期觀察腫瘤體積及重量，病理，電鏡超微結構，增殖活性，逆轉錄多聚酶鏈反應(reverse trarlscription polychain reaction，rt-PCR)熒光定量檢測各組腫瘤中與細胞增殖分化遷徙有關的CyclinDl、CDK4、

5、ICAM的表達水平。 結果 11個月中連續(xù)裸鼠皮下傳4代，共移植裸鼠79只，移植一周內局部移植塊逐漸消退，7周后肉眼見腫瘤逐漸增大，鼠間傳代潛伏期為50±3天，總成瘤率45.1％，第二代長期飼養(yǎng)的4只荷瘤鼠平均生存時間為285±34天，最長荷瘤時間是319天，每代移植瘤接種后第8周倍增時間為4.5±0.2天，潛伏期及倍增時間在各代較均一。 鏡檢可見移植瘤周圍結締組織邊界清楚，未見明顯腫瘤組織侵入周圍組織，各代移植

6、瘤細胞生長活躍，各代之間細胞形態(tài)一致，間質細胞少見，細胞呈小圓形，核漿比例大，核染色深，保留原視網(wǎng)膜母細胞瘤的組織學特征。 免疫組化檢測NSE、S-100、SYN、CHG-Al在各代腫瘤細胞均可見表達，陽性率分別為100％、97.1％、73.6％、65.4％。 圖像分析結果提示各代移植瘤DNA指數(shù)(DNA index，DI)保持一致，提示移植瘤各代能維持與原代相同的細胞學特征。試驗結束時給藥組平均瘤重(2.750±0.3

7、02 g)低于對照組(7.150±1.228 g)(p=0.008)及維甲酸缺乏組(11.483±2.721g)(p=0.003)。 鏡檢給藥組腫瘤細胞大片出血壞死，無明顯炎性細胞浸潤，可見較多向間葉組織分化的細胞，對照組與原移植瘤的病理表現(xiàn)相同，維甲酸缺乏組核漿比大，核染色較對照組深。 電鏡示給藥組細胞線粒體明顯腫脹，空泡化，核糖體較對照組明顯減少，出現(xiàn)較多溶酶體。對照組細胞同原移植瘤一致，核漿比大，核染色深，胞漿中游

8、離核糖體較多，線粒體較少，溶酶體少見。維甲酸缺乏組游離核糖體較對照組多，溶酶體少見。 逆轉錄熒光定量各組增殖分化及遷徙的相關基因表達指標在給藥組與對照組CyclinD1(p=0.012)CDK4(p=0.010)有顯著統(tǒng)計學差異，ICAM-I(p=0.071)未見有顯著統(tǒng)計學差異；維甲酸缺乏組與對照組，CyclinD1(p=0.017)、CDK4(p=0.029)有統(tǒng)計學差異，ICAM-I(p=0.083)未見有顯著統(tǒng)計學差異。

9、 結論 1．本實驗應用6周齡BALB/L(nu/nu)裸小鼠成功建立了人視網(wǎng)膜母細胞瘤裸小鼠模型，已穩(wěn)定傳至第四代?？偝闪雎蕿?5.1％，潛伏期為50±3天，倍增時間為4.5±0.2天。 2．移植瘤的生物特性與原腫瘤相似，光鏡組織病理和電鏡超微結構觀察發(fā)現(xiàn)各代腫瘤形態(tài)特征相近，免疫組化可見NSE、S-100、CHG-A1、SYN表達均在各代腫瘤中保持一致，細胞圖象分析可見各代腫瘤細胞增殖活躍。 3．全反式