視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤綜合治療及與腫瘤血管生成細(xì)胞因子關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景:
　　 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)是嬰幼兒最常見的一種原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害患兒生命及視功能。隨著臨床治療水平的不斷提高，治療的目標(biāo)也從單純局限于保護(hù)患兒生命轉(zhuǎn)向立足于提高患兒的生存質(zhì)量，即保留眼球和有用視功能的方向發(fā)展，而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的最關(guān)鍵問題在于患兒的早期發(fā)現(xiàn)和診斷。由于Rb患兒的年齡一般都在3歲以下，腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)相當(dāng)困難，這不僅是由于兒童眼底檢查配合不佳，更是缺乏清晰、直觀的檢

2、查成像手段所造成的。廣域數(shù)字化小兒視網(wǎng)膜圖像系統(tǒng)（wide-field digital pediatric retinal imagingsystem，RetCamⅡ）作為目前最先進(jìn)的兒童眼底成像技術(shù)為Rb的防治及持續(xù)隨訪提供了極大地便利。但長(zhǎng)期以來仍缺乏對(duì)于Rb臨床信息的完整收集及整理分析系統(tǒng)，只能采取簡(jiǎn)單的文字描述或繪圖進(jìn)行記錄，不利于患兒臨床長(zhǎng)期隨訪觀察和持續(xù)的綜合治療療效評(píng)估。有鑒于此，我們希望利用計(jì)算機(jī)技術(shù)建立一套收集Rb圖像

3、和文字信息的圖文一體化系統(tǒng)，為Rb的防治研究提供信息支持。通過吸入麻醉下的眼底成像技術(shù)與信息采集系統(tǒng)相結(jié)合的Rb圖文系統(tǒng)，可以使眼科醫(yī)師獲得全面完整、準(zhǔn)確直觀的患兒信息資料，促進(jìn)了Rb的臨床診斷、治療和隨訪等各個(gè)方面的發(fā)展，更好的把握Rb的眼底表現(xiàn)特征和病變進(jìn)展情況，有效的幫助臨床醫(yī)師采取合理干預(yù)措施，對(duì)于提高患兒的生存質(zhì)量也具有重要的價(jià)值。本研究創(chuàng)建的一整套的檢查方式和圖文輸出，在臨床教學(xué)和科研中也具有良好的應(yīng)用前景。
　　

4、目前，隨著化療為主的綜合治療的興起，Rb患兒的診療模式也發(fā)生了巨大的變化，常規(guī)外放射治療漸漸淡出主流治療范圍，原有的Reese-Ellsworth5級(jí)分期體系已不再能夠適應(yīng)新的要求，本世紀(jì)初產(chǎn)生了新的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤國(guó)際分期(International Intraocular Retinoblastoma Classification，IIRC)，2005年全球共有27個(gè)中心參與，包括我國(guó)的同仁眼科中心，證明了IIRC對(duì)于Rb化療的指導(dǎo)作

5、用。但我國(guó)Rb患兒就診時(shí)多為晚期，保守治療效果相對(duì)較差。因此，臨床治療仍是目前面臨的最主要最現(xiàn)實(shí)的問題，我院自2008年開始組建了Rb專業(yè)治療組，開展現(xiàn)代Rb的綜合治療，取得了不錯(cuò)的效果，同時(shí)收集了豐富的臨床資料。本課題由此點(diǎn)出發(fā)，通過對(duì)近5年來的Rb綜合治療以及23G微創(chuàng)玻璃體手術(shù)聯(lián)合球內(nèi)注藥化療的新型治療方式做一全面的評(píng)估與分析，以達(dá)到提高Rb治療水平、探索符合我國(guó)國(guó)情的個(gè)體化治療手段的目的。
　　 長(zhǎng)期以來，防止Rb的復(fù)發(fā)

6、和轉(zhuǎn)移是其治療中最為棘手的難點(diǎn)。40年前，F(xiàn)olkman首次提出腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是有血管依賴性的，因此阻斷腫瘤的血管化可以作為腫瘤治療的有效策略。VEGF及其相關(guān)的因子作為刺激血管生成的最強(qiáng)大的細(xì)胞因子群在腫瘤新生血管化的過程中占據(jù)中心地位，是介導(dǎo)新生血管生成的關(guān)鍵因素。有鑒于此，結(jié)合以上思路，我們選取綜合治療成功和失敗的部分Rb患兒，抽取其血清，運(yùn)用RayBiotech人血管生成相關(guān)細(xì)胞因子芯片檢測(cè)治療后Rb患兒血清中43種VEGF及

7、其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況，整體的、動(dòng)態(tài)的評(píng)估蛋白質(zhì)分子水平的變化情況，從VEGF及其相關(guān)因子群為核心的腫瘤新生血管化的角度探討Rb的臨床治療預(yù)后和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　 機(jī)體生理機(jī)能的真正執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，因此從蛋白質(zhì)水平對(duì)疾病進(jìn)行研究顯得特別重要。抗體芯片技術(shù)作為一種高通量的分子蛋白檢測(cè)技術(shù)，繼承了免疫熒光、化學(xué)發(fā)光和微列陣技術(shù)的諸多特點(diǎn)，逐漸發(fā)展成為從整體角度定性和定量檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的研究平臺(tái)，在各種疾病的相關(guān)分子發(fā)現(xiàn)、分子診斷

8、和療效評(píng)價(jià)方面發(fā)揮重要作用，具有良好的應(yīng)用前景。本研究希望利用這一技術(shù)從整體的宏觀角度了解腫瘤血管新生化的微環(huán)境中復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，從而探索未來潛在的Rb治療新的介入手段和干預(yù)策略。
　　 研究目的:
　　 1.建立視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤臨床圖文信息采集系統(tǒng)，收集管理Rb患兒所有的臨床信息及眼底圖片資料，為掌握Rb發(fā)病的機(jī)制和規(guī)律，總結(jié)和探索Rb治療特點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　 2.探討視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤臨床診治與IIRC

9、分期特點(diǎn)
　　 3.研究視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤綜合治療的特點(diǎn)并探討其相關(guān)臨床因素，探索適合國(guó)情的個(gè)體化綜合治療方式;初步總結(jié)23G微創(chuàng)玻璃體手術(shù)聯(lián)合球內(nèi)注藥化療治療Rb的臨床經(jīng)驗(yàn)和預(yù)后效果，摸索晚期Rb治療的新方法;同時(shí)研究眼摘前的化療與晚期Rb患兒腫瘤轉(zhuǎn)移及死亡率的相關(guān)性。
　　 4.利用細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)綜合治療保眼成功和失敗的相同分期患兒治療后血清中43種血管生成相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化，從腫瘤新生血管化的角度探討

10、Rb的臨床治療和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.使用JAVA軟件語言，建立視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤臨床信息采集系統(tǒng)，收集整理近十年的Rb臨床資料，為分析Rb的診療特點(diǎn)及規(guī)律提供信息支持。
　　 2.回顧性分析我院2003年至2012年十年間116例Rb患兒的臨床資料。
　　 3.分析我院從2009年至2012年間進(jìn)行綜合治療的75例Rb患兒的臨床資料，綜合治療的方法包括:化療、局部治療（激光或冷凍）、眼

11、球摘除、玻璃體手術(shù)聯(lián)合球內(nèi)注藥。其中采取以化療為主聯(lián)合局部治療+眼摘治療的患兒65例，其余10例為23G微創(chuàng)玻璃體手術(shù)聯(lián)合球內(nèi)注藥化療的手術(shù)干預(yù)治療。
　　 4.利用pTNM分級(jí)和特定疾病生存率(Disease-specific survival，DSS)的方法研究眼摘前的化療與晚期Rb患兒腫瘤轉(zhuǎn)移及死亡率之間的相關(guān)性。
　　 5.RayBiotech人血管生成相關(guān)細(xì)胞因子芯片檢測(cè)治療后不同預(yù)后的Rb患兒血清中43種細(xì)胞

12、因子的表達(dá)情況。
　　 6.數(shù)據(jù)分析采用版本2.15.1的R統(tǒng)計(jì)軟件中的卡方檢驗(yàn)，T檢驗(yàn)，F(xiàn)isher's精確檢驗(yàn)，Wilcoxon等級(jí)總和檢驗(yàn)和生存率分析。P≤0.05認(rèn)為有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.建立了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤臨床信息的采集系統(tǒng)，主要有三個(gè)模塊組成:文字報(bào)告模塊、影像圖片模塊及病例查詢模塊，系統(tǒng)可以生成完整的Rb患兒圖文報(bào)告資料。
　　 2.分析116例Rb患兒臨床資料的IIRC特

13、點(diǎn)，其中單眼患兒為79例(68.1％)，雙眼患兒為37例(31.9％);有遺傳性家族史的單眼患兒為1例(1.27％)，雙眼患兒為5例(13.51％)，兩者經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異，P≤0.05;在Rb患兒中最常見的初診癥狀為白瞳癥，比例為78.4％;性別方面男性74例(63.79％)，女性42例(36.21％);患兒總體的初診時(shí)間、診斷滯后時(shí)間及隨診時(shí)間分別為21.49個(gè)月、5.14周及30.72個(gè)月，單眼患兒的初診時(shí)間為24.27個(gè)月，

14、雙眼患兒為15.1個(gè)月，單雙眼患兒的初診時(shí)間經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異，P≤0.05;所有患兒中腫瘤為單個(gè)瘤體的占75％，多個(gè)瘤體的占25％; Rb患兒的IIRC國(guó)際分期方面，所有153只患眼中A期占5只(3.27％)，B期占7只(4.58％)，C期占11只(7.19％)，D期占56只(36.60％)，E期占69只(45.10％)，自發(fā)退變的占4只(2.61％)，另有1只眼由于在外院摘除而分期不明;所有患眼中眼球摘除的有97眼，占63.4％

15、，總體保眼率為36.6％;從各分期的保眼率來看A期為5眼(100％)，B期為7眼(100％)，C期為9眼(81.82％)，D期為24眼(42.86％)，E期為10眼(14.49％)，其余自發(fā)退變的4眼中有3眼由于萎縮而摘除。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析A、B、C期之間無顯著性差異，P＞0.05;A、B、C期與D、E期之間均有顯著性差異，P≤0.05。
　　 3.化療為主聯(lián)合局部治療+眼摘治療的所有65例92眼（雙眼27例，單眼38例）Rb患兒四

16、年的總生存率為92.3％，A期至E期的生存率分別為100％、100％、100％、95％和90.00％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示各期存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P＞0.05;所有患兒總的保眼率為51％，A期至E期的保眼率分別為100％、100％、85.70％、77.10％和10％，各組間采用兩獨(dú)立樣本卡方檢驗(yàn)，A、B、C、D各期之間保眼率無顯著性差異，P＞0.05;但E期和其他各期之間保眼率均有顯著性差異，P≤0.05;中低風(fēng)險(xiǎn)Rb患兒綜合治療結(jié)果

17、:A，B，C期共15只眼，治療成功14只眼，失敗1只眼，治療成功率為93.3％;高風(fēng)險(xiǎn)Rb患兒綜合治療結(jié)果:D、E期Rb患兒共60例，采用化療聯(lián)合局部治療保眼的共42例，分別為D期18例和E期24例，D期的保眼治療成功率為61.1％(11/18)，E期的保眼治療成功率為16.7％(4/24)，其余18例均為單純眼摘或眼摘后化療的患兒。進(jìn)一步分析42例D期和E期的保守治療與臨床因素相關(guān)性，治療成功與失敗患兒的初診時(shí)間分別為12和16.1個(gè)

18、月，隨訪時(shí)間分別為22.47和28個(gè)月，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均無顯著性差異，P＞0.05;與腫瘤位置相關(guān)性分析，將42例患兒眼內(nèi)腫瘤的位置分為3組即:后極部、周邊部（包括中周部）和后極部+周邊部，三組治療成功的例數(shù)分別為4例，6例，5例;成功率分別為23.50％，85.70％，27.80％，經(jīng)卡方分析后極部與周邊部、周邊部與后極部+周邊部有顯著性差異，P≤0.05;42例患兒中有4例死亡，全部為腫瘤位置處于后極部的患兒，其他兩組位置的患兒均無死

19、亡，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，后極部與后極部+周邊部?jī)山M之間有顯著性差異，P≤0.05;另外各組間均無顯著性差異，P＞0.05。
　　 4.23G微創(chuàng)玻璃體手術(shù)聯(lián)合球內(nèi)注藥化療治療的Rb患兒10例，平均術(shù)后隨訪時(shí)間6.4個(gè)月，術(shù)中硅油填充的患兒有4例，其中2例已經(jīng)取出硅油，有7例患兒術(shù)后視力有提高，1例同術(shù)前，2例下降，所有患兒眼球保存，保眼率為100％，未發(fā)現(xiàn)眼外轉(zhuǎn)移，腫瘤灶基本鈣化萎縮，1例患兒術(shù)后發(fā)生玻璃體少量出血，2例術(shù)后發(fā)生輕度脈

20、絡(luò)膜脫離，1例發(fā)生持續(xù)球結(jié)膜水腫，后經(jīng)治療好轉(zhuǎn)，未發(fā)現(xiàn)其他嚴(yán)重并發(fā)癥。
　　 5.用pTNM分級(jí)和特定疾病生存率(DSS)的分析方法對(duì)41例的Rb組織病理學(xué)報(bào)告（26男，15女，雙眼16例，單眼25例，摘除的眼球13眼為D期，28眼為E期）進(jìn)行研究。每位患者僅以一只眼分期納入統(tǒng)計(jì)，雙側(cè)Rb患者按病情較重側(cè)患眼的分期參與研究。眼球摘除術(shù)作為首選治療方式的有16只眼，另外25只眼為眼摘前做了化療治療的。這兩組在性別，單側(cè)與雙側(cè)發(fā)病，

21、患眼的國(guó)際分級(jí)或者診斷年齡方面經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異，P＞0.05。五名死亡的患兒均為眼摘前化療組E期患兒，雙眼兩名，單眼3名。雙眼患兒整體的平均診斷年齡為19.3個(gè)月，范圍2-54個(gè)月，單眼患兒整體的平均診斷年齡為25.5個(gè)月，范圍4-72個(gè)月;首選治療是眼摘的生存患兒的隨診時(shí)間（平均31.1個(gè)月，范圍11-52個(gè)月）長(zhǎng)于眼摘前化療的生存患兒隨診時(shí)間（平均26.4個(gè)月，范圍10-50個(gè)月）。首選眼球摘除的患兒從診斷到眼球摘除的平均時(shí)

22、間是0.9個(gè)月，而眼摘前化療的患兒從診斷到眼球摘除的時(shí)間中位數(shù)是5.7個(gè)月，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異，P≤0.05。
　　 患兒特定疾病生存率分析:患兒的生存時(shí)間從診斷時(shí)開始計(jì)算，死亡患兒到死亡日期止。由于死亡患兒均為E期的患者，因此比較E期未行化療直接眼摘患兒與眼摘前行化療治療患兒的DSS，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者接近有顯著性差異，P=0.05。眼摘時(shí)間推遲3個(gè)月以上的患兒相對(duì)于3個(gè)月內(nèi)眼摘的患兒DSS有顯著性差異，P≤0.05。

23、r>　　 分析41例眼球摘除的病理組織片的pTNM分級(jí)，總體來看，眼摘前化療組患兒與未化療組患兒pTNM的風(fēng)險(xiǎn)性相比，兩者無顯著性差異，P＞0.05;但在高風(fēng)險(xiǎn)方面，眼摘前化療組患兒的比例為12％，而眼摘前未化療組患兒的比例為37.5％，前者的高風(fēng)險(xiǎn)比例明顯要少;分期比較，在D期中兩組具有顯著性差異，P≤0.05，即化療組比未化療組的風(fēng)險(xiǎn)低;但在E期的患兒中兩組的風(fēng)險(xiǎn)性沒有顯著性差異，P＞0.05
　　 6.抽取綜合治療后保眼

24、成功和失敗的Rb患兒外周血，進(jìn)行血清中43種血管生成相關(guān)細(xì)胞因子的抗體芯片檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11種細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)生改變，有顯著性差異。其中:發(fā)生表達(dá)上調(diào)的2種，為IFN-γ和Endostatin;發(fā)生表達(dá)下調(diào)的9種，為ENA-78、Angiopoietin-2、VEGF-R2、MCP-1、VEGF、MMP-9、IL-1β、PIGF和Tie-2。
　　 結(jié)論:
　　 1.使用Java語言程序創(chuàng)建了Rb患兒臨床信息的圖文采集系

25、統(tǒng)，可以完整的搜集、整理各種患兒信息資料，并可將資料數(shù)據(jù)以EXECL表的形式輸出，同時(shí)可以形成包含患兒病情和診療情況的圖文報(bào)告。
　　 2.白瞳癥是Rb患兒中的初診癥狀中比例最高的臨床表現(xiàn)，超過患兒總數(shù)的3/4;與國(guó)外相比，我國(guó)患兒的初診時(shí)間和病程普遍偏晚，且腫瘤以單發(fā)為主所占比重最大，比率達(dá)到75％;分期上也以D期和E期為主的晚期病患為主，超過了80％。治療上，保眼率為36.6％，且眼摘率和分期密切相關(guān)。說明我國(guó)的Rb診斷和治

26、療水平還比較低，患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多病情嚴(yán)重，預(yù)后不佳，需要加強(qiáng)對(duì)民眾的Rb健康教育，提高Rb早期診斷的水平，探索出新的有效且經(jīng)濟(jì)的個(gè)體化治療新方法。
　　 3.化療為主聯(lián)合局部治療+眼摘治療的綜合治療手段提高了Rb患兒的生存率，但患者的生存率和保眼率與其臨床分期密切相關(guān)，晚期病例的治療效果不佳，眼摘率較高;同時(shí)治療預(yù)后與腫瘤所處的位置有高度相關(guān)性。腫瘤的位置對(duì)于臨床治療的選擇性具有指導(dǎo)意義，也是影響臨床Rb綜合治療療效的重要因素。

27、r>　　 4.對(duì)于晚期的化療失敗或效果不佳的Rb患兒，玻璃體手術(shù)聯(lián)合球內(nèi)注藥的治療新方法短期內(nèi)的觀察效果良好，保眼率為100％，且術(shù)后未見嚴(yán)重的手術(shù)并發(fā)癥，是一種安全有效的治療手段，但還需要今后大樣本長(zhǎng)期的觀察評(píng)估。
　　 5.如果從診斷到眼球摘除的時(shí)間超過3個(gè)月，對(duì)那些組織病理學(xué)上分期較差的嚴(yán)重E期Rb患兒進(jìn)行眼摘前的化療治療，同時(shí)沒有密切監(jiān)控和適當(dāng)?shù)膶?duì)高風(fēng)險(xiǎn)因素的處理，可能將導(dǎo)致因?yàn)檗D(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)造成的死亡率升高。研究結(jié)果提示

28、在晚期的Rb治療中要適度掌握治療的分寸，即如何避免保眼治療后帶來的可能腫瘤轉(zhuǎn)移問題，在何種情況下要及時(shí)堅(jiān)決的摘除眼球或采取保眼治療，怎樣把握兩者之間的平衡關(guān)系是今后需要深入研究和總結(jié)的關(guān)鍵問題。
　　 6.使用細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)可以檢測(cè)不同預(yù)后的Rb患兒血清中血管生成類細(xì)胞因子的表達(dá)變化情況，以VEGF/VEGF R2和Ang2/Tie2為核心的腫瘤血管化是Rb綜合治療預(yù)后效果的重要影響因素，腫瘤的預(yù)后轉(zhuǎn)歸是一個(gè)以血管生成化為

29、核心的、復(fù)雜的涉及免疫、炎癥、轉(zhuǎn)移侵襲、凋亡的病理生理過程，VEGF/VEGF R2和Ang2/Tie2可以作為今后Rb治療的新的靶點(diǎn)，具有巨大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 創(chuàng)新點(diǎn):
　　 1.構(gòu)建了一套行之有效的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤圖文信息采集系統(tǒng)。
　　 2.提出了23G微創(chuàng)玻璃體手術(shù)聯(lián)合球內(nèi)注藥化療治療晚期視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的新思路，并進(jìn)行了初步總結(jié)，為Rb綜合治療提供了新的手段。
　　 3.提出了過度化療或保