GALV致融性糖蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肺腺癌細胞的抗腫瘤實驗研究.pdf

1、第一部分攜帶GALV．fus基因的重組單純皰疹病毒的組裝、擴增及鑒定 目的：包裝已成功構(gòu)建的受HSV-I晚期表達基因-UL38啟動子調(diào)控的、嗜腫瘤單純皰疹病毒介導(dǎo)的GALV．fus基因質(zhì)粒(HSV-UL38P-GALV.fus)，無腫瘤特異性巨細胞病毒啟動子(CMVP)GALV.fus質(zhì)粒(HSV-CMVP-GALV.fus)，GALV.fus基因片段被增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因片段所取代的治療對照質(zhì)粒(HSV-CMVP

2、-EGFP)，分別命名為Synco-2、Synco-1、Baco-1。 方法：擴增已成功構(gòu)建的HSV-UL38P-GALV.fus、HSV-CMVP-GALV.fus、HSV-CMVP-EGFP質(zhì)粒，然后分別在Vero細胞用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、包裝成重組嗜腫瘤單純皰疹病毒。重組單純皰疹病毒的擴增及純化采用Vero細胞及氯化銫純化常規(guī)方法，病毒滴度測定采用TCID50法。Synco-1、Synco-2病毒感染肝癌細胞株HepG2，分別提取

3、受染肝癌細胞HepG2的總RNA，以RT-PCR的方法鑒定GALV.fus基因的表達。 結(jié)果：成功包裝了3種重組單純皰疹病毒Baco-1、Synco-1和Synco-2，按需要在Vero細胞內(nèi)擴增后以氯化銫密度梯度離心法進行純化，TCID50法測得病毒滴度分別為3×1O<'10>pfu/ml，1×10<'11>pfu/ml和4×10<'10>pfu/ml。受染肝癌細胞株HepG2中以RT-PCR法檢測到GALV.fus基因的表達

4、。 第二部分 UL38和CMV啟動子調(diào)控嗜腫瘤單純皰疹病毒介導(dǎo)的GALV.fUS基因系統(tǒng)治療肺癌的體外試驗研究 目的：探討HSV-I晚期表達基因-UL38啟動子及無腫瘤特異性巨細胞病毒啟動子調(diào)控的嗜腫瘤單純皰疹病毒介導(dǎo)GALV.fus基因系統(tǒng)體外對人肺腺癌的選擇性殺傷效應(yīng)。 方法： (1)細胞培養(yǎng) 肺腺癌細胞A549培養(yǎng)取含10％新鮮胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；正常人胚胎成纖維細胞(HFL-

5、I GNHu5)取DMEM培養(yǎng)基。置5％CO2孵箱中，飽和濕度及37℃培養(yǎng)。 (2)重組嗜腫瘤HSV-I病毒對肺癌細胞的致融性鑒定 將生長良好的A549細胞以1×10<'5>個/孔接種于6孔板，將0.01 pfu重組嗜腫瘤HSV-I病毒(Baco-1、Synco-1和、Synco-2)加入各孔，空白對照組以PBS替代。感染24h后，在倒置顯微鏡下觀察及照相。 (3)重組嗜腫瘤HSV-I病毒感染肺癌細胞的殺傷效率測

6、定 將生長良好的A549細胞以3×10<'4>個/孔接種于24孔板，將0.01 pfu重組單純皰疹病毒(Baco-1、Synco-1和Synco-2)加入各孔。感染24h及48h后，收集細胞，用trypan blue染色后，倒置熒光顯微鏡下觀察，鏡下計數(shù)活細胞數(shù)。 (4)不同MOI的重組嗜腫瘤HSV-I病毒對A549細胞的殺傷作用 24孔板接種細胞株A549，分別加入不同MOI的單純皰疹病毒進行轉(zhuǎn)染(MOI=0.

7、01、0.1、1)，空白對照組以PBS替代。5％CO<,2>孵箱37℃培養(yǎng)48h后，收集細胞，用trypan blue染色后，倒置顯微鏡下觀察，計數(shù)活細胞數(shù)。 (5)重組嗜腫瘤HSV-I病毒對體外細胞的特異性鑒定試驗 選用人胚胎成纖維細胞(HFL-I GNHu 5)作為試驗對象，采用0.01pfu重組嗜腫瘤單純皰疹病毒Synco-1和Synco-2感染。感染后，采用三種方法維持細胞生長：(1)10％胎牛血清DMEM維持，

8、使細胞處于旺盛生長狀態(tài)；(2)無血清DMEM維持，使細胞處于分裂靜止狀態(tài)；(3)無血清DMEM聯(lián)合細胞分裂抑制藥物洛伐他汀(Lovastatin)，使細胞處于完全分裂抑制狀態(tài)。24和48小時觀察不同病毒對正常細胞的影響。 (6)重組單純皰疹病毒受染細胞GALV.fus基因的檢測 分別提取已感染肺癌細胞A549和正常人胚胎成纖維細胞(HFL-I GNHu5)的總蛋白，以Western Blot法鑒定GALV.fus基因的表

9、達。 結(jié)果： (1)對肺癌細胞的致融性鑒定：倒置顯微鏡下觀察顯示，加入重組嗜腫瘤HSV-I病毒24h后，含GALV.fus基因的致融性病毒嗜腫瘤在肺癌細胞內(nèi)引起強烈的細胞膜融合，數(shù)十至數(shù)百細胞融合形成巨大細胞融合斑。而非致融病毒Baco-1僅引起病毒細胞毒性效應(yīng)，細胞呈圓形，鏡下未見細胞融合斑。 (2)重組HSV-I病毒感染肺癌細胞的殺傷效率測定：致融病毒載體Synco-1，Synco-2殺傷肺癌細胞的能力(70

10、-90％)明顯優(yōu)于非致融病毒載體Baco-1，兩者比較，差異明顯。 (3)不同MOI的重組HSV-I對A549細胞的殺傷作用； (4)重組HSV-I病毒對體外細胞的特異性鑒定試驗。 (5)重組單純皰疹病毒受染細胞GALV.fus基因的檢測。 第三部分嗜腫瘤單純皰疹病毒載體介導(dǎo)的GALV.fus基因系統(tǒng)治療肺腺癌的體內(nèi)試驗研究 目的：探討重組嗜腫瘤單純皰疹病毒介導(dǎo)的GALV.fus基因系統(tǒng)在體內(nèi)對人

11、肺癌的殺傷效應(yīng)及建立人肺腺癌皮下瘤裸鼠模型的最佳方案。 方法： (1)裸鼠肺癌模型建立方案的研究： ①模型建立方案：選用4-6周裸鼠20只，以三種不同細胞劑量(1X10<'6>個/只、1X10<'7>個/只及1X10<'9>個/只)的細胞懸液及組織塊接種法(1cmx1cmx2cm)對裸鼠右側(cè)背腹部皮下進行皮下接種，觀察成瘤情況，測量腫瘤的最大直徑(a)和最大橫徑(b)，計算腫瘤的體積(V=1/2ab<'2>)，比

12、較成瘤效果。 ②裸鼠肺癌模型病理學(xué)鑒定：裸鼠肺癌模型建立方案研究結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死裸鼠，無菌取出腫瘤，以4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡觀察腫瘤組織的病理變化。 (2)GALV.fus基因系統(tǒng)治療肺腺癌的體內(nèi)試驗研究 ①裸鼠肺癌模型的建立及分組：本實驗采用細胞懸液接種法。選用4-6周裸鼠28只，將肺癌細胞用PBS配成5×10<'7>細胞/ml的細胞懸液。在小鼠右側(cè)背腹部皮下接種0.2ml細胞

13、懸液。觀察小鼠腫瘤生長情況，當腫瘤生長至直徑約為7mm時，選用瘤體大小一致的荷瘤裸鼠25只，隨機分為A-E共5組，每組5只，所余荷瘤裸鼠3只為F組。A組為PBS對照組；B組為Baco-1組；C組為Synco-1組；D組、E組為Synco-2組，其中E組為腫瘤組織GALV.fus表達檢測組；F組為體內(nèi)細胞毒性試驗組。 ②重組單純皰疹病毒體內(nèi)細胞毒性試驗：F組荷瘤裸鼠3只于第1、7天經(jīng)尾靜脈注射Synco-2純化病毒液1×10<'8

14、>pfu 0.1ml。首次注射14天后，脫頸處死，無菌取出裸鼠腦、心、肺、腎、脾、小腸、肝臟組織，以4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡觀察腫瘤組織的病理變化。 ③重組單純皰疹病毒治療腫瘤的療效觀察：B組為Baco-1組，C組為Synco-1組，D、E組為Synco-2組，于第1、7天每組裸鼠腫瘤內(nèi)分別注射純化病毒液1×10<'8>pfu 0.1ml；A組為對照組，裸鼠體內(nèi)僅注射PBS。自注射病毒開始，每4天測量腫瘤大

15、小，計算腫瘤的體積，描繪腫瘤的生長曲線，共觀察4周。觀察結(jié)束后處死裸鼠，解剖觀察瘤體的大體形態(tài)，取對照組和治療組的腫瘤組織稱重。 ④荷瘤鼠腫瘤組織GALV.fus的表達 1)首次注射純化病毒液后2周提取E組Synco-2病毒感染腫瘤組織5例總RNA，RT-PCR法檢測受染細胞GALV.fus基因的表達鑒定。 2)分別提取己感染病毒腫瘤組織及對照未感染病毒腫瘤組織各1例的總蛋白，以Western Blot法鑒定GA

16、LN.fus基因的表達。 結(jié)果： (1)裸鼠肺癌模型建立方案的研究。 (2)重組單純皰疹病毒對荷瘤裸鼠肺癌的療效觀察。 (3)重組單純皰疹病毒體內(nèi)細胞毒性試驗。 (4)荷瘤鼠腫瘤組織GALV.fus的表達。 結(jié)論： 1.本研究成功包裝了已構(gòu)建的分別由UL38啟動子和CMV啟動子調(diào)控的攜帶GALV.fus基因和EGFP基因的重組嗜腫瘤單純皰疹病毒HSV-UL38P-GALV.fus、

17、HSV-CMVP-GALV.fus和HSV-CMVP-EGFP。對其進行純化、擴增后具有較高的滴度，并在肝癌細胞株HepG2中以RT-PCR法檢測到受染細胞GALV.fus基因的表達。 2.重組嗜腫瘤單純皰疹病毒HSV-UL38P-GALV.fus和HSV-CMVP-GALV.fus能特異性轉(zhuǎn)染并殺傷肺腺癌A549細胞，其轉(zhuǎn)染效率隨MOI的增高而增加；UL38啟動子控制下的重組嗜腫瘤單純皰疹病毒Synco-2在正常細胞HFL-I