人肺腺癌細(xì)胞總RNA電穿孔法轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞疫苗的體外的抗腫瘤效應(yīng)研究.pdf

1、目的:從人重組的粒細(xì)胞集落刺激因子(human recombination granulocyte colony stimulating factor,rhG-CSF)動(dòng)員的外周血干細(xì)胞采集物中分離誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs),探討人肺腺癌細(xì)胞株A549總RNA電穿孔法轉(zhuǎn)染DCs來制備疫苗的可行性,并觀察DCs疫苗在體外誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力。
　　方法:用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rh

2、GM-CSF)和重組人白細(xì)胞介素4(rh IL-4)從血細(xì)胞分離機(jī)分離出的外周血采集物中誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生,同時(shí)從人肺腺癌細(xì)胞A549中提取總RNA用以轉(zhuǎn)染DCs,并用轉(zhuǎn)染后的DCs與自體T細(xì)胞共同培養(yǎng),誘導(dǎo)成為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)。實(shí)驗(yàn)分未轉(zhuǎn)染DCs組,轉(zhuǎn)染PBS的DCs組,轉(zhuǎn)染RNA的DCs組,以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)鑒定DCs、T細(xì)胞表型、RT-PCR證明總RNA轉(zhuǎn)染效率,MTT檢

3、測T細(xì)胞增殖能力及乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定殺傷腫瘤活性,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測IL-12、IFN-γ分泌水平并比較各組差異。
　　結(jié)果:1)RT-PCR證明電穿孔法可成功使A549的總RNA轉(zhuǎn)染入DCs并可使DCs表達(dá)腫瘤抗原。2)RNA轉(zhuǎn)染組的DCs表面標(biāo)志物CD40、CD80、CCR-7、CD83、HLA-DR都呈強(qiáng)陽性表達(dá),表達(dá)率明顯高于PBS轉(zhuǎn)染組DCs和未轉(zhuǎn)染組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);3)流式

4、結(jié)果顯示RNA轉(zhuǎn)染的DCs刺激后的T細(xì)胞表面標(biāo)志物CD8比例明顯上升;4)RNA轉(zhuǎn)染組IL-12、IFN-γ分泌水平明顯高于PBS轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組(P<0.05);5)RNA轉(zhuǎn)染組DCs可以有效刺激T淋巴細(xì)胞增殖,并且誘導(dǎo)腫瘤特異性CTLs產(chǎn)生,對A549細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷作用。而PBS轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組則無明顯作用(P<0.05)。
　　結(jié)論:利用密度梯度離心法可以從經(jīng)rhG-CSF動(dòng)員的外周干血細(xì)胞采集物中分離誘導(dǎo)動(dòng)員的外周血干