4-1BBL轉(zhuǎn)基因胃癌細胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細胞疫苗的研究.pdf

1、目的:胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,近幾年發(fā)病率呈上升趨勢,且發(fā)病亦趨于年輕化,而進展期胃癌的綜合治療效果較差,其5年生存率徘徊在30％左右。其難以治愈的原因之一與腫瘤的免疫逃逸有關(guān),抗腫瘤免疫以T細胞介導(dǎo)的細胞免疫為主,T細胞的活化需雙信號刺激,其中第二信號由抗原提呈細胞(Antigen-presenting cell,APC)上的共刺激分子與T細胞上的相應(yīng)配體提供,缺乏第二信號的作用可導(dǎo)致T細胞特異性無應(yīng)答反應(yīng)。大量研究證實腫瘤細

2、胞可通過缺乏共刺激分子的方式逃避機體免疫。
　　 樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)是體內(nèi)功能最強大的抗原提呈細胞,能夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)并維持初始免疫反應(yīng)。其功能表現(xiàn)在識別和吞噬病原體,將大分子抗原加工成肽段,刺激未致敏T細胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。用樹突狀細胞疫苗治療腫瘤是當前腫瘤治療領(lǐng)域的熱點之一,在諸多類型的樹突狀細胞疫苗中更多研究者將目光集中在用全腫瘤信息負載DC,以多個抗原表位的免疫反應(yīng),有效地防止由于抗原變異而

3、引起的免疫逃避。
　　 4.1BB/4-1BBL是CD28/B7之外的另一對重要的協(xié)同刺激信號,4-1BBL屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員,主要表達于活化的B細胞和T細胞、單核細胞、樹突狀細胞(DC)、神經(jīng)母細胞瘤細胞及一些腫瘤細胞上。主要在初次免疫應(yīng)答的后期起作用,4-1BBL可協(xié)同CD28或單獨發(fā)揮對靜止T細胞的活化作用,維持T細胞的生存及免疫記憶應(yīng)答。
　　 本研究將4-1BBL基因?qū)胛赴┘毎?并提取此胃癌

4、細胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細胞制備腫瘤疫苗,并觀察疫苗的體外抗腫瘤效應(yīng),為胃癌的臨床免疫治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1：用脂質(zhì)體法把pMKITneo/4-1BBL基因?qū)?15小鼠前胃癌細胞MFC內(nèi),G418進行篩選至長出G418抗性克隆,成為MFC/4-1BBL細胞。
　　 2：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT

5、-PCR)鑒定轉(zhuǎn)染細胞中4-1BBL基因mRNA的存在。
　　 3：自615小鼠骨髓組織中分離樹突狀細胞(DC),并進行體外培養(yǎng)使之進一步成熟。
　　 4：用脂質(zhì)體包裹MFC/4-1BBL細胞總RNA轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細胞,制備DC/4-1BBL/RNA疫苗。
　　 5：取615同種異體小鼠脾淋巴細胞,與DC、MFC/4-1BBL/DC混合培養(yǎng),利用MTT法測各組淋巴細胞增值率。DC、MFC/4-1BBL/DC與小鼠

6、淋巴細胞共培養(yǎng)后刺激T細胞產(chǎn)生特異性CTL細胞,利用MTT法測定腫瘤細胞的殺傷率;ELISA法測定幼稚DC、DC、MFC/4-1BBL/DC培養(yǎng)上清中IL-12的含量及MFC/4-1BBL/DC、DC與T細胞共培養(yǎng)后上清中IFN-γ含量。所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,P＜0.05時認為差異具有顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1：4-1BBL基因轉(zhuǎn)染MFC細胞后的鑒定:
　　 MFC經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染4-1

7、BBL基因、G418篩選后,均獲得陽性克隆(MFC/4-1BBL)。提取MFC/4-1BBL細胞總RNA,經(jīng)RT-PCR可得到616bp的特異性條帶,證實有4-1BBL的mRNA較強表達。
　　 2：樹突狀細胞的形態(tài)學觀察;
　　 倒置顯微鏡下觀察,培養(yǎng)第3天,細胞數(shù)量明顯增加,體積增大,部分細胞懸浮生長并聚集成團,呈集落樣生長。培養(yǎng)第5天,以懸浮生長為主,體積無明顯變化,部分細胞出現(xiàn)足狀突起或毛刺狀突起,集落明顯增多。

8、轉(zhuǎn)染后12h,細胞形態(tài)基本恢復(fù)至未轉(zhuǎn)染前狀態(tài)。
　　 3：MTT法測定轉(zhuǎn)染前后DC對淋巴細胞的增殖能力:
　　 刺激細胞與效應(yīng)細胞比值分別為1:20、1:10、1:5時各組MFC/4-1BBL/DC對T細胞的增殖作用(0.093±0.012、0.187±0.013、0.187±0.013)均強于相應(yīng)比值下DC對T細胞的增殖作用(0.060±0.014、0.148±0.017、0.195±0.015);且隨刺激細胞與效應(yīng)細

9、胞比值增高,增值作用逐漸增強。
　　 4：MTT法測定轉(zhuǎn)染前后DC激活T細胞殺傷腫瘤的活性:
　　 靶細胞與效應(yīng)細胞比值分別為1:20、1:10、1:5時各組MFC/4-1BBL/DC激活CTL細胞對腫瘤細胞的殺傷率(0.533±0.092、0.321±0.018、0.218±0.025)高于DC激活CTL細胞對腫瘤細胞的殺傷率(0.342±0.023、0.267±0.0243、0.147±0.031),P＜0.05;且

10、隨效靶比增大,殺傷率逐漸增高。
　　 5：ELISA法測定培養(yǎng)液上清中IL-12、IFN-γ的含量:
　　 IL-12由多到少依次為MFC/4-1BBL/DC(20.240±2.494 pg/ml)、DC(17.088±3.933 pg/ml)、幼稚DC(10.288±2.390pg/ml),DC明顯高于幼稚DC。MFC/4-1BBL/DC(9.451±2.925 pg/ml)與T細胞共培養(yǎng)后上清中IFN-γ含量高于DC

11、組(5.979±1.639 pg/ml)。
　　 結(jié)論:
　　 1：4-1BBL基因應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染后,可以在小鼠胃癌MFC細胞內(nèi)穩(wěn)定表達;且應(yīng)用轉(zhuǎn)染后的MFC細胞的總RNA轉(zhuǎn)染DC后可以得到穩(wěn)定活性的DC疫苗。
　　 2：MFC/4-1BBL/DC對T細胞的增殖作用強于DC;且MFC/4-1BBL/DC培養(yǎng)液上清中IL-12的含量明顯高于其余各組。提示此疫苗可提高T細胞增殖能力及機體免疫力。
　　 3：