重組腺病毒介導(dǎo)的PSMA-4-1BBL轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)抗前列腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的
　　 構(gòu)建pAdxsi-GFP-PSMA和pAdxsi-GFP-4-1BBL兩種重組腺病毒,將其轉(zhuǎn)染DC構(gòu)建成DC疫苗,體外實(shí)驗(yàn)觀察此DC疫苗呈遞前列腺特異性膜抗原及活化T細(xì)胞的能力是否增強(qiáng),另用其誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)生成,觀察其對(duì)前列腺癌的治療效果,為下一步應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 一、PSMA和4-1BBL腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
　　 用Adxsi系統(tǒng)構(gòu)建攜帶PS

2、MA、4-1BBL基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體(pAdxsi-GFP-PSMA和pAdxsi-GFP-4-1BBL)并大量制備。TCID50法測(cè)定病毒滴度,并用PCR法鑒定兩種基因的表達(dá)。
　　 二、健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)及其體外感染腺病毒效率的測(cè)定
　　 分離健康志愿者外周血PBMC,加入不同細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)DC,培養(yǎng)第5天時(shí)分成5組,分別按MOI為50、100、200、3

3、00、400加入Ad-GFP,于12,24,48h熒光倒置顯微鏡下觀察同一MOI下綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá);同時(shí)在轉(zhuǎn)染48h后流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)不同MOI下GFP陽(yáng)性率,并用PE-7AAD凋亡和壞死試劑盒檢測(cè)不同MOI下DC細(xì)胞的存活情況,摸索最適MOI。
　　 三、樹(shù)突狀細(xì)胞感染PSMA/4-1BBL基因重組腺病毒后的免疫功能變化
　　 分離健康志愿者外周血PBMC,加入不同細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)DC、T,

4、按最適MOI,在DC中加入相應(yīng)的病毒量,分成五組:Ad-PSMA/4-1BBL共轉(zhuǎn)染DC組、Ad-PSMA-DC組、Ad-4-1BBL-DC組、Ad-GFP-DC組和普通未轉(zhuǎn)染DC組,熒光倒置顯微鏡觀察DC的形態(tài)學(xué)變化,培養(yǎng)48h后WesternBlotting法鑒定PSMA與4-1BBL基因在DC中的表達(dá),直接免疫熒光法檢測(cè)未感染DC與腺病毒感染后DC上CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá),ELISA試劑盒測(cè)定各組DC疫苗

5、培養(yǎng)上清中IL-12分泌量的變化。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)測(cè)定不同組DC疫苗對(duì)T細(xì)胞增殖的影響,另外可確定DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)的最佳細(xì)胞比例。ELISA試劑盒測(cè)定不同DC-CTL組培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-10的分泌量。CCK-8法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組DC-CTL細(xì)胞及CTL細(xì)胞分別對(duì)三種前列腺癌細(xì)胞(LNCap、Du145、22RV)的殺傷活性。
　　 結(jié)果
　　 1、經(jīng)酶切電泳、測(cè)序、PCR法鑒定,證實(shí)重組腺病毒載體(pAdxsi

6、-GFP-PSMA和pAdxsi-GFP-4-1BBL)構(gòu)建正確,插入片段包含PSMA和4-1BBL基因序列,Ad-PSMA滴度為2×10pfu/ml,Ad-4-1BBL滴度為1.2×10pfu/ml。
　　 2、同一MOI下轉(zhuǎn)染48h后轉(zhuǎn)染效率最高,另確定最佳MOI為200。
　　 3、PSMA和4-IBBL蛋白可以在DC上正常表達(dá),腺病毒感染后不會(huì)影響DC的成熟及形態(tài)學(xué)改變,共轉(zhuǎn)染組DC表面CD80、CD83、CD8

7、6、HLA-DR共刺激分子均上調(diào),明顯高于其它DC組;上清液中IL-12分泌水平共轉(zhuǎn)染組(134.29±2.22)pg明顯高于單個(gè)轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05);DC:T同一比例下,共轉(zhuǎn)染組刺激自體T細(xì)胞增殖能力明顯高于其他轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05),各組DC疫苗與T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)PSMA/4-1BBL-DC-CTL組IFN-γ分泌量最高,達(dá)1176.10±14.37pg/2×106cells,IL-10分泌量最低,為75.14±

8、2.01pg/2×106cells,與其他各組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);效靶比為40:1時(shí)腫瘤殺傷作用最強(qiáng),在同一效靶比時(shí)PSMA/4-1BBL-DC-CTL對(duì)LNCap的殺傷率明顯高于對(duì)另兩種前列腺癌細(xì)胞DU145、22RV的殺傷率(P＜0.05),也明顯高于其它DC-CTL組的殺傷率(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建了Ad-GFP-PSMA和Ad-GFP-4-1BBL病毒質(zhì)粒,體外