PSCA重組腺病毒轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)CD8+CTL對前列腺癌體內(nèi)體外殺瘤效果評價.pdf

1、前言:
　　前列腺癌是男性中最常見的上皮惡性腫瘤之一，患者早期無明顯特異性臨床癥狀，因此，確診時多數(shù)患者已發(fā)展至中晚期，患者錯過癌癥最佳治療時期，導(dǎo)致前列腺癌患者預(yù)后效果差、死亡率高。遺傳因素、過多性生活、不良飲食習(xí)慣等因素增加了前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險，使得前列腺癌具有較高的發(fā)病率。因此，前列腺癌的治療成為了廣大科研工作者的研究重點。
　　手術(shù)、化療和放療是癌癥治療的常見治療方式。手術(shù)治療作為癌癥治療的首選能夠完全移除腫瘤，然而

2、對晚期腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療效果有限，同時對患者造成永久性創(chuàng)傷?；熥鳛槿碇委熓侄文軌驓喾N腫瘤細(xì)胞且取得了良好的癌癥治療效果。然而由于化療藥物缺乏特異性，常引起患者出現(xiàn)免疫功能低下、肝腎損傷、骨髓抑制等不良反應(yīng)，限制了化療藥物癌癥治療的應(yīng)用。放療在腫瘤治療中的地位和作用受到了廣泛的關(guān)注，然而放療受腫瘤病理分級、細(xì)胞分化程度、增殖速度、細(xì)胞含氧量等多種因素影響，降低了放療應(yīng)用范圍。內(nèi)分泌治療是中晚期前列腺癌治療的首選治療方案，但內(nèi)分

3、泌治療難以完全殺滅腫瘤細(xì)胞，并且導(dǎo)致雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)生以及性欲減退、肌力降低等多種副作用。因此，尋找新型方案成為了前列腺癌治療的關(guān)鍵。
　　腫瘤免疫治療是一種利用免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的新型癌癥治療方式，具有副作用小、特異性強等優(yōu)點。其通過提高腫瘤細(xì)胞免疫原性以及免疫效應(yīng)細(xì)胞的腫瘤殺傷敏感性達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。樹突細(xì)胞(Dendritic cell，DC)作為專職抗原呈遞細(xì)胞，能夠有效攝取和加工處理抗原，然后通過主

4、要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ呈遞抗原并激活初始T細(xì)胞，實現(xiàn)啟動、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的作用。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)能夠根據(jù)呈遞的抗原而特異性識別腫瘤細(xì)胞，能夠通過Fas/FasL途徑促進促凋亡相關(guān)蛋白分泌，同時釋放穿孔素與顆粒酶達(dá)到溶解細(xì)胞的目的。因此，選擇合適抗原決定CTL的腫瘤識別能力和抗腫瘤功能。
　　前列腺干細(xì)

5、胞抗原(Prostate stem cell anti gen，PSCA)主要在前列腺上皮細(xì)胞表面表達(dá)，其通過葡萄糖磷脂酰肌醇共價錨定于細(xì)胞膜表面。PSCA在惡性腫瘤組織如前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)程度與腫瘤組織病理分級、分化程度、播散程度等呈正相關(guān)，并且在正常人類組織組織如前列腺基底細(xì)胞表面中呈現(xiàn)低表達(dá)。由于PSCA是一種特異性膜表達(dá)抗原，而不是分泌型，與PSA、PAP等分泌型抗原相比具有獨一無二的優(yōu)勢在誘導(dǎo)免疫耐受方面，

6、所以PSCA不僅是前列腺癌等相關(guān)腫瘤診斷及預(yù)后判斷的重要生物學(xué)指標(biāo)，同時也是腫瘤免疫治療的潛在的重要靶點。由于其特有的性質(zhì)和明顯的優(yōu)勢使PSCA成為了腫瘤免疫治療的理想靶點。
　　來自自身細(xì)胞突變的前列腺癌細(xì)胞具有較弱的抗原性，同時其能夠分泌多種細(xì)胞因子而抑制DC的抗原攝取和呈遞能力，導(dǎo)致腫瘤患者免疫功能低下。因此，提高DC的抗原攝取和呈遞能力對提高機體腫瘤細(xì)胞殺傷能力具有重要意義。重組腺病毒是重要的分子生物學(xué)工具，能將外源基因轉(zhuǎn)

7、至細(xì)胞內(nèi)且能夠促進蛋白分子持續(xù)表達(dá)而不損傷細(xì)胞，同時具有安全性好、轉(zhuǎn)染效率高、操作簡單等優(yōu)點。因此利用重組腺病毒能夠引起DC持續(xù)性表達(dá)PSCA，提高了DC抗原加工處理和呈遞能力。
　　本研究擬構(gòu)建PSCA重組腺病毒表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染人DC而提高其抗原呈遞能力以及激活初始T淋巴細(xì)胞能力，從而獲得抗原特異性CD8+ CTL。同時檢測了PSCA特異性CD8+CTL的前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞殺傷效果，并進一步進行了動物模型實驗。
　　材料與

8、方法:
　　一、實驗材料
　　1、細(xì)胞株:
　　PC-3（人前列腺癌細(xì)胞）、LNcap（人前列腺癌細(xì)胞）和RWPE-1（人前列腺上皮細(xì)胞）購于ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)及消化傳代按照ATCC細(xì)胞培養(yǎng)說明進行。
　　2、實驗動物
　　4-5周齡Balb/c-nu/nu雄性裸鼠購買于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，裸鼠飼養(yǎng)及相關(guān)實驗嚴(yán)格按照動物福利法要求進行。
　　3、組織標(biāo)本
　　外周血采集自成年健康男性志愿者

9、。
　　二、主要研究方法
　　1、PSCA重組腺病毒構(gòu)建以及鑒定:擴增PSCA基因并通過Adxsi系統(tǒng)構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體pAdxsi-PSCA，然后大量制備該載體。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后進行PSCA重組腺病毒包裝以及擴增。通過CsCl密度梯度離心進行病毒純化，并采用TCID50法進行病毒滴度測定。通過PCR法對重組腺病毒PSCA基因進行鑒定。
　　2、采集健康男性志愿者外周血，收集單核細(xì)胞源性樹突細(xì)胞，體外誘

10、導(dǎo)培養(yǎng)后進行重組腺病毒轉(zhuǎn)染:通過密度梯度離心法收集加入淋巴細(xì)胞分離液的外周血中的單核細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用于DC培養(yǎng)，非貼壁細(xì)胞用于T細(xì)胞培養(yǎng)。利用PSCA-GFP重組腺病毒進行DC轉(zhuǎn)染，同時通過流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微鏡確定最佳MOI值和最佳感染時間。同時通過Western blot鑒定AdPSCA轉(zhuǎn)染DC的PSCA蛋白表達(dá)情況。
　　3、通過倒置相差顯微鏡觀察AdPSCA轉(zhuǎn)染對DC形態(tài)影響;利用流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測重組腺病毒轉(zhuǎn)

11、染DC后細(xì)胞表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR表達(dá)情況，同時利用ELISA法檢測重組腺病毒轉(zhuǎn)染對DC表達(dá)白介素(IL)-1O和IL-12表達(dá)影響;通過遷移實驗檢測重組腺病毒轉(zhuǎn)染對DC遷移能力的影響。
　　4、AdPSCA-DC與初始T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，利用CCK-8法確定AdPSCA-DC對自體及異體T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響;經(jīng)過3輪刺激后，并利用免疫磁珠分選CD8+CTL，確定AdPSCA-DC誘導(dǎo)CD8+CTL產(chǎn)

12、生情況。
　　5、通過Western blot確定PC-3、LNcap和RWPE-1中PSCA表達(dá)情況;利用流式細(xì)胞儀測定AdPSCA-DC-CD8+CTL對PC-3細(xì)胞最佳殺傷比例;利用流式細(xì)胞儀測定DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL分別對PC-3、LNcap和RWPE-1殺傷效果。
　　6、通過酶聯(lián)免疫斑點實驗測定在PC-3、LNcap和RWPE-1存在條件下，D

13、C-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL表達(dá)干擾素(IFN)-γ表達(dá)情況。
　　7、檢測DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL抑制腫瘤形成情況。
　　8、Balb/c-nu/nu雄性裸鼠背部皮下注射PC-3細(xì)胞，構(gòu)建前列腺癌荷瘤裸鼠模型。
　　9、檢測DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPS

14、CA-DC-CD8+CTL對荷瘤裸鼠的腫瘤殺傷情況、體重影響以及存活時間影響。
　　10、利用蘇木精-伊紅(HE)染色檢測各組CD8+CTL處理后腫瘤組織病理學(xué)改變情況以及利用免疫組織化學(xué)染色檢測各組CD8+CTL處理后腫瘤組織中VEGF、Bax和Bcl-2表達(dá)情況。
　　11、統(tǒng)計學(xué)分析:上述實驗重復(fù)至少3次。采用SPSS17.0對文中數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用SNK-q

15、檢驗， P＜0.05代表比較有顯著差異。
　　結(jié)果:
　　1、通過酶切、瓊脂糖電泳、測序和PCR鑒定，證實成功構(gòu)建PSCA重組腺病毒載體，病毒滴度達(dá)到2.5×1011pfu/ ml;通過流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡確定最佳轉(zhuǎn)染MOI為200，最佳感染時間為48h。
　　2、通過Western blot證實AdPSCA轉(zhuǎn)染DC后，DC表達(dá)PSCA蛋白。
　　3、PSCA重組腺病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)DC出現(xiàn)典型形態(tài)學(xué)變化;同時DC

16、細(xì)胞表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR陽性細(xì)胞率升高;AdPSCA提高了IL-12表達(dá)量同時抑制了IL-10表達(dá);同時AdPSCA提高了DC遷移能力。
　　4、AdPSCA-DC提高了T細(xì)胞增殖能力，同時能夠大量誘導(dǎo)CD8+CTL產(chǎn)生。
　　5、Western blot發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞PC-3高表達(dá)PSCA蛋白，前列腺癌細(xì)胞LNcap較高表達(dá)PSCA蛋白，前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1低表達(dá)PSCA蛋白。

17、　　6、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)AdPSCA-DC-CD8+CTL最佳PC-3腫瘤細(xì)胞殺傷比例為40∶1。AdPSCA-DC-CD8+CTL對RWPE-1、LNcap和PC-3的殺傷比例達(dá)到8.87％±3.12、30.19％±4.13和52.60％±5.78，依次是Adnull-DC-CD8+CTL的1.31倍、4.54倍和7.37倍，同時是DC-CD8+CTL的1.81倍、5.81倍和10.31倍。

18、　　7、酶聯(lián)免疫斑點實驗表明:PC-3細(xì)胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL高表達(dá)IFN-γ，LNcap細(xì)胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL較高表達(dá)IFN-γ，RWPE-1細(xì)胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL弱表達(dá)IFN-γ;相關(guān)細(xì)胞刺激后，Adnull-DC-CD8+CTL和DC-CD8+CTL弱表達(dá)IFN-γ。
　　8、AdPSCA-DC-CD8+CTL抑制PC-3細(xì)胞在Balb/c-nu/nu雄性裸鼠背部形成

19、腫瘤。
　　9、經(jīng)AdPSCA-DC-CD8+CTL處理后，荷瘤裸鼠腫瘤體積比（4.89±2.26）明顯低于PBS(27.43±2.76)、DC-CD8+CTL(25.74±2.10)和Adnull-DC-CD8+CTL(24.81±2.41)處理組，同時平均存活時間(37d)顯著長于PBS(22d)、DC-CD8+CTL(22d)和Adnull-DC-CD8+CTL(22d)處理組;經(jīng)過治療后4組荷瘤裸鼠體重未見明顯降低。

20、>　　10、AdPSCA-DC-CD8+CTL處理后，HE染色發(fā)現(xiàn)腫瘤組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色表明腫瘤組織中VEGF和Bcl-2表達(dá)量明顯下調(diào)而Bax表達(dá)量明顯升高。
　　結(jié)論:
　　1、本研究成功構(gòu)建PSCA重組腺病毒載體。
　　2、PSCA重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染促進了DC表型及免疫功能成熟，獲得PSCA陽性DC。
　　3、AdPSCA-DC促進了T淋巴細(xì)胞增殖和CD8+CTL產(chǎn)生。
　　4、