麥冬皂苷D’經(jīng)RIP1-MLKL通路抑制前列腺癌生長(zhǎng)的體內(nèi)體外研究.pdf

1、背景及目的:
　　癌癥的高致病率和高死亡率已成為嚴(yán)重的健康及社會(huì)問(wèn)題。2015年中國(guó)約有4，292，000例新發(fā)癌癥病例，約有2，814，000例死于癌癥。前列腺癌是發(fā)達(dá)國(guó)家男性中最常診斷出的腫瘤。盡管亞洲及我國(guó)屬于前列腺癌低發(fā)地區(qū)，但2005～2011年間我國(guó)前列腺癌發(fā)病率環(huán)比上升4.7％;2000～2011年間我國(guó)因前列腺癌導(dǎo)致的死亡率環(huán)比上升5.5％。前列腺癌已成為危害我國(guó)男性健康的主要疾病之一。年齡是前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)因素之一

2、，50％以上的發(fā)病率和90％以上的死亡率發(fā)生在65歲及以上的男性中。隨著中國(guó)男性期望壽命的延長(zhǎng)和社會(huì)人口老齡化趨勢(shì)的加劇，將可能會(huì)有更多的男性罹患前列腺癌。
　　前列腺癌早期主要為雄激素依賴性腫瘤，去勢(shì)治療（主要是通過(guò)雄激素剝奪實(shí)現(xiàn)的）是其主要治療方式之一。去勢(shì)療法中使用雄激素剝奪治療(Androgen-deprivationtherapy，ADT)抑制雄激素的作用可以預(yù)防前列腺癌的進(jìn)展。去勢(shì)治療往往帶來(lái)多種并發(fā)癥，如潮熱、性欲喪

3、失、肌肉減少、疲勞、認(rèn)知功能障礙、脂肪分布改變及抑郁。長(zhǎng)期不良反應(yīng)包括骨質(zhì)疏松和貧血，甚至患代謝綜合征、心血管疾病以及死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加。同時(shí)，并不是所有患者都對(duì)去勢(shì)治療有效，或者持續(xù)有效。有數(shù)據(jù)顯示，ADT的有效中位數(shù)時(shí)間只有18個(gè)月，患者可能進(jìn)一步發(fā)展成為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castrate-resistant prostate cancer, CRPC），而CRPC患者的死亡率高，臨床結(jié)局差?；熑匀皇荂RPC的主要治療手段，鑒于目前

4、化療藥物的局限性，尋找CRPC新的化療藥物尤為重要。
　　天然化合物是來(lái)源于植物、動(dòng)物、海洋生物或者微生物的一類具有生物活性的小分子物質(zhì)。事實(shí)上，有超過(guò)60％的抗腫瘤藥物來(lái)源于天然產(chǎn)物，天然化合物往往成為很多抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物，進(jìn)而研發(fā)出真正能使用的臨床抗腫瘤藥物，所以天然化合物又被稱為抗腫瘤藥物的資源庫(kù)。皂苷類化合物是從植物皂苷中提取的一類化合物，有研究顯示其可通過(guò)抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡、阻滯前列腺癌細(xì)

5、胞周期從而發(fā)揮抗腫瘤作用。我們的前期研究顯示，來(lái)源于桔梗的皂苷類化合物-桔梗皂苷甙D具有抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期，并抑制裸鼠前列腺癌移植瘤的作用。我們選擇了來(lái)自中藥麥冬中的一類與桔梗皂甙D結(jié)構(gòu)類似的化合物，麥冬皂苷D'(Ophiopogonin D'，OPD')，對(duì)其抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。
　　自2005年程序性壞死(necroptosis)的概念提出以來(lái)，其在腫瘤細(xì)胞死亡中的作用受到廣泛關(guān)注

6、。程序性壞死兼有壞死的形態(tài)學(xué)特征（即細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜完整性破壞）和受基因調(diào)控的特點(diǎn)，其不受caspase抑制劑的影響但卻能被靶向于受體相互作用蛋白1(receptor-interactingprotein1，RIP1)的程序性壞死特異性抑制劑(necrostatin1，Nec-1)所抑制?；旌献V系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)是執(zhí)行程序性壞死的核心分子。當(dāng)細(xì)

7、胞發(fā)生程序性壞死時(shí)，MLKL磷酸化使單體MLKL發(fā)生寡聚，寡聚的MLKL從細(xì)胞質(zhì)中遷移至細(xì)胞膜形成開(kāi)放性孔道，導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死。目前研究顯示，程序性壞死機(jī)制在誘導(dǎo)結(jié)腸癌、淋巴瘤、口腔癌細(xì)胞等的死亡中發(fā)揮重要作用，而對(duì)前列腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，綠茶提取物茶多酚可誘導(dǎo)前列腺癌PC3細(xì)胞程序性壞死。
　　麥冬皂苷D'(Ophiopogonin D'，OPD')是從麥冬中提取的皂苷類化合物，其對(duì)前列腺癌的作用還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以雄激素非依賴的

8、PC3細(xì)胞為研究對(duì)象，在體外實(shí)驗(yàn)中研究OPD'作用于PC3細(xì)胞的效應(yīng)及其機(jī)制，同時(shí)運(yùn)用PC3細(xì)胞裸鼠移植瘤模型研究OPD'在體內(nèi)抑制前列腺癌效果，并對(duì)OPD'的毒副作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OPD'對(duì)PC3細(xì)胞存活的影響;
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)OPD'對(duì)PC3細(xì)胞AnnexinⅤ-FITC、PI雙染的影響;
　　3.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加入caspase抑制劑后OPD'對(duì)PC3細(xì)胞存活

9、的影響;
　　4.臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OPD'對(duì)PC3細(xì)胞胞膜完整性的影響;
　　5.乳酸脫氫酶(LDH)釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OPD'對(duì)PC3細(xì)胞釋放LDH的影響;
　　6.吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OPD'對(duì)PC3細(xì)胞胞膜完整性的影響;
　　7.結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)觀察OPD'對(duì)PC3細(xì)胞形態(tài)的影響;
　　8.透射電鏡實(shí)驗(yàn)觀察OPD'對(duì)PC3細(xì)胞形態(tài)的影響;
　　9.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加入程序性壞死抑制劑后OP

10、D'對(duì)PC3細(xì)胞存活的影響;
　　10.Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OPD'對(duì)RIP1、cleaved-RIP1、MLKL以及p-MLKL蛋白表達(dá)的影響;
　　11.MTD實(shí)驗(yàn)確定后續(xù)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)的給藥劑量并對(duì)OPD'的毒性進(jìn)行初步評(píng)價(jià);
　　12.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)OPD'在體內(nèi)抑制PC3移植瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.OPD'可有效抑制PC3細(xì)胞存活，其半數(shù)抑制劑量(IC50)

11、為6.25±0.31μM;
　　2.流式細(xì)胞術(shù)顯示，5μM OPD'主要誘導(dǎo)PC3細(xì)胞晚期凋亡/壞死，且只在晚期凋亡/壞死象限中呈明顯的時(shí)間依賴關(guān)系;
　　3.5μM OPD'誘導(dǎo)PC3細(xì)胞caspase非依賴的死亡，凋亡不是其發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的主要機(jī)制;
　　4.5μM OPD'誘導(dǎo)PC3細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性、LDH釋放增加、EB染色陽(yáng)性，胞膜破裂;
　　5.5μM及以上OPD'誘導(dǎo)PC3細(xì)胞細(xì)胞腫脹、胞核溶解，形

12、態(tài)學(xué)上呈壞死樣改變，從形態(tài)學(xué)證實(shí)OPD'誘導(dǎo)PC3細(xì)胞壞死;
　　6.OPD'誘導(dǎo)PC3細(xì)胞程序性壞死;
　　7.5μM OPD'顯著下調(diào)cleaved-RIP1表達(dá)，同時(shí)上調(diào)RIP1表達(dá)，cleaved-RIP1/RIP1比值下降，表明OPD'經(jīng)由RIP1誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞程序性壞死。
　　8.5μM OPD'顯著上調(diào)p-MLKL(220KD)表達(dá)，同時(shí)對(duì)MLKL表達(dá)無(wú)影響，p-MLKL/MLKL比值上升，表明OPD'

13、經(jīng)由p-MLKL誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞程序性壞死。
　　9.MTD實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常昆明小鼠可耐受20 mg/kg OPD'腹腔注射，確定裸鼠移植瘤的最大給藥劑量為5 mg/kg;
　　10.5 mg/kg OPD'腹腔注射干預(yù)24天，可顯著抑制PC3移植瘤的生長(zhǎng)速度及大小，且有3只裸鼠的腫瘤在給藥干預(yù)之后完全消失，其腫瘤生長(zhǎng)抑制率達(dá)到79.79％。
　　11.5 mg/kg OPD'處理組裸鼠體重沒(méi)有明顯下降，表明OPD'

14、體內(nèi)使用無(wú)明顯毒副作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　OPD'在體外可有效抑制雄激素非依賴的PC3細(xì)胞的存活，其發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)主要機(jī)制不是凋亡，而是程序性壞死，且主要經(jīng)由RIP1/MLKL通路。在整個(gè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)期間，OPD'干預(yù)后裸鼠可較好地維持體重，表明OPD'對(duì)裸鼠沒(méi)有明顯的毒副作用。5mg/kg OPD'腹腔注射干預(yù)24天顯著抑制了PC3移植瘤的生長(zhǎng)速度及大小，且有3只裸鼠的腫瘤在給藥干預(yù)之后完全消失。由此可見(jiàn)，OPD'可顯著抑