熱休克蛋白-抗原肽復(fù)合物激活的樹突狀細胞疫苗抗腫瘤效應(yīng)的研究.pdf

1、開發(fā)更有效的抗腫瘤疫苗一直是腫瘤免疫治療的主要目標之一。本論文選擇Hca-F和L929細胞系為模型，在體外比較卡介苗來源的HSP70-肽復(fù)合物(HSP70-BCG)和Hca-F欖香烯復(fù)合瘤苗來源的HSP70-肽復(fù)合物(HSP70-EC-TCV)沖激的DCs抗Hca-F和L929效應(yīng)；探討Toll-likeReceptor4(TLR4)信號通路在HSP70-BCG和HSP70-EC-TCV激活DCs過程中的作用；體外構(gòu)建的Hca-F欖香烯

2、復(fù)合瘤苗抗原肽-HSP70-BCG復(fù)合物(HTA-HSP70-BCG)激活的DCs的體內(nèi)外抗瘤效應(yīng)，主要結(jié)果如下： 一.HSP70-BCG和HSP70-EC-TCV抗原肽復(fù)合物對DCs的沖激作用 1.HSP70-BCG和HSP70-EC-TCV由本室從Hca-F欖香烯復(fù)合瘤苗細胞和BCG中提取，Westernblot證實，全過程以低壓液相色譜監(jiān)控。 2.骨髓來源的不成熟DC通過在培養(yǎng)基中加入GM-CSF(20ng

3、/ml)和IL-4(20ng/ml)培養(yǎng)5天獲得。 3.以HSP70-BCG(25μg/ml)和HSP70-EC-TCV(25μg/ml)沖激DC24h，用ELISA法檢測上清中IL-12濃度，用流式細胞儀檢測DC表面CD86和CD40的表達。 4.用不同沖激的DCs刺激脾T細胞，ELISA法檢測24h、48h和72h上清中IL-2濃度。以Hca-F和L929為靶細胞，通過MTT法測定刺激5天的T細胞的細胞毒活性。

4、 二.TLR4對HSP70-BGG和HSP70-EC-TCV誘導(dǎo)DCs成熟的影響 1.骨髓來源的DC，在培養(yǎng)基中含GM-CSF20ng/ml和IL-420ng/ml條件下培養(yǎng)5天獲得，該DCs被培養(yǎng)在24孔板中，分別加入HSP70-BCG25μg/ml、HSP70-EC-TCV25μg/ml、LPS1μg/ml；另取三個孔，提前半小時加入抗TLR4抗體10μg/ml封閉TLR4后，再分別加入三種刺激物(LPS為陽性對照)。24

5、h后取上清用ELISA法檢測IL-12濃度，收獲細胞用流式細胞儀檢測CD86和CD40的表達。 2.從脾分離的T細胞在24孔板中培養(yǎng)，分別加入HSP70-BCG、HSP70-EC-TCV沖激的DCs、LPS刺激的DCs，預(yù)先用Anti-TLR4抗體處理后再沖激的DC和不成熟DC(對照)，于24h收集上清用ELISA法測IL-2濃度，于5天收獲T細胞用于細胞毒試驗；以Hca-F為靶細胞，與不同處理的DCs培養(yǎng)72h，用MTT法檢測

6、細胞毒活性。 .三.體外構(gòu)建的HTA-HSP70-B~對小鼠骨髓DCs的沖激作用 1.從欖香烯處理的Hca-F細胞提取腫瘤抗原肽(HTA)、HSP70-BCG和ADP按一定比例混合，使之相互作用形成復(fù)合物(HTA-HSP70-BCG)，收集培養(yǎng)5天的不成熟DCs，分別加入HSP70-BCG25μg/ml，HTA25μg/ml和HTA-HSP70-BCG25μg/ml，在6孔板中培養(yǎng)24h，收集細胞做細胞表型分析。

7、 2.將全脾細胞與不同處理的DCs共同培養(yǎng)72h，用MTT法測定增殖活性顯不，HSP70-BCG和HTA-HSP70-BCG沖激的DCs組增殖指數(shù)大于HTA組，將全脾細胞與不同處理的DC共同培養(yǎng)5天，分別以Hca-F和L929為靶細胞，3天后用MTT法測細胞毒活性。 四.HTA-HSP70-BCG誘導(dǎo)的DCs的體內(nèi)抗瘤作用 1.取健康BALB/C(SPF)小鼠40只，第0天右腋皮下接種Hca-F細胞2×105/只，第五天

8、隨機分成5組，每組8只，雌雄各半，分別為：(1)攻擊對照組，不進行任何治療；(2)環(huán)磷酰胺化療組，第五天在接種部位注射環(huán)磷酰胺(CTX)100mg/kg體重(2.5mg/只)；(3)環(huán)磷酰胺+不成熟DC組，注射CTX6小時后，于小鼠左腋皮下注射不成熟DCs與脾細胞混合物3×106/只；(4)環(huán)磷酰胺+HTA-HSP70-BCG組，注射CTX6小時后，于小鼠左腋皮下注射HTA-HSP70-BCG復(fù)合物50μg/只；(5)環(huán)磷酰胺+HTA-

9、HSP70-BCGDCs組，注射CTX6小時后，于小鼠左腋皮下注射HTA-HSP70-BCG沖激的DCs與脾細胞混合物3×106/只。于第26天解剖小鼠，稱瘤重。 2.制備各組小鼠全脾細胞作為效應(yīng)細胞，以Hca-F瘤細胞為靶細胞，培養(yǎng)72小時，只有HTA-HSP70-BCG沖激的DCs組脾細胞對Hca-F有細胞毒作用(與對照和CTX相比，P＜0.05)。 本研究證實HSP70-BCG、HSP70-EC-TCV和HTA-H

10、SP70-BCG在體外均可誘導(dǎo)DCs成熟；TLR4信號傳導(dǎo)通路參與HSP70-BCG和HSP70-EC-TCV誘導(dǎo)的DCs成熟，對DCs分泌IL-12是必要的；體外構(gòu)建的HTA-HSP70-BCG沖激的DC瘤苗可有效激活荷瘤小鼠的淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗瘤效應(yīng)，而HTA-HSP70-BCG、不成熟DCs在已荷瘤的小鼠體內(nèi)不能誘導(dǎo)出抗瘤效應(yīng)，說明荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤細胞抗原表達及DCs均存在缺陷，為在體外構(gòu)建DC疫苗對腫瘤進行生物治療提供實驗依