人食管癌細胞熱休克蛋白70肽復合物的提取及其抗瘤活性的研究.pdf

1、研究背景 食管癌是我國常見的惡性腫瘤之～，對食管癌治療的研究除了手術、放療和化療外，最引人注目的是食管癌腫瘤疫苗的研究。腫瘤疫苗輸注病人體內后通過激活腫瘤患者自身的免疫系統(tǒng)，引起特異性的抗腫瘤反應，對腫瘤起特異性殺傷作用，達到治愈腫瘤的目的，因而具有高度特異性。 熱休克蛋白70是體內廣泛表達的一種保守蛋白，是熱休克蛋白的一種，在熱休克等應激狀態(tài)下表達增加。研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，在食管癌的研究中也

2、發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70與食管癌的腫瘤浸潤程度、腫瘤病理類型和淋巴結轉移有關。研究人員發(fā)現(xiàn)，從腫瘤組織或細胞提取的熱休克蛋白具有保護機體抵御同種腫瘤再次攻擊的能力，熱休克蛋白腫瘤疫苗成為了一種新的腫瘤疫苗。已有研究表明在肝癌、肺癌、胃癌和黑色素瘤等腫瘤中提取的熱休克蛋白70肽復合物具有在體內外產(chǎn)生抗腫瘤作用的活性，而在食管癌中的研究尚未見報道。 在對熱休克蛋白腫瘤疫苗的研究中存在多種腫瘤疫苗形式，其中將熱休克蛋白肽復合物與DC聯(lián)合或者

3、將熱休克蛋白肽復合物與腫瘤抗原相結合的疫苗形式為常見的疫苗方式，但對于不同腫瘤，腫瘤疫苗的不同應用形式效果不同。在研究腫瘤疫苗的抗腫瘤作用中，找到最佳的腫瘤疫苗形式，也是決定腫瘤疫苗能否發(fā)揮最大作用的關鍵問題。 實驗目的 從食管癌細胞株EC-109中分離提取熱休克蛋白70肽復合物，研究熱休克蛋白70肽復合物的抗腫瘤活性及特異性；將熱休克蛋白70肽復合物聯(lián)合DC或MHC-I類抗原肽，研究不同形式熱休克蛋白70腫瘤疫苗的抗腫

4、瘤作用；研究熱休克蛋白70肽復合物對DC和T淋巴細胞的作用，對其抗腫瘤機制進行初步探討，為HSP70肽復合物作為食管癌腫瘤疫苗的應用提供實驗基礎。 實驗方法 1. 食管癌細胞HSP70-PCs的提純： 體外培養(yǎng)食管癌EC-109細胞，42~C制造細胞熱休克，收集109細胞，裂解，超聲破碎細胞；制備CNBr-Sepharose4B親和層析柱，將細胞裂解上清加入層析柱，經(jīng)親和層析分離純化蛋白； 2. HSP7

5、0-PCs的定性、定量檢驗： 利用SDS-PAGE凝膠電泳、銀染、Westernblot進行定性及純度檢驗，通過紫外分光光度計檢測蛋白濃度； 3. HSP70-PCs抗腫瘤活性的研究： 將HSP70-PCs加入T淋巴細胞，誘導CTL產(chǎn)生，將共孵育3天的T細胞按40：1加入預先接種了腫瘤細胞的孔板中，分別作用于食管癌細胞(EC．109)、胃癌細胞(BGC-823)和肝癌細胞(SMMC-7721)，采用MTT法檢測H

6、SP70-PCs的抗腫瘤作用和抗腫瘤特異性； 4. 不同HSP70-PCs腫瘤疫苗的抗腫瘤效果： 體外分離人外周血單核細胞，分離培養(yǎng)樹突狀細胞(DCs)和T淋巴細胞，體外培養(yǎng)的DCs，負載HSP70-PCs，與T細胞共孵育，誘導CTL，檢測對不同腫瘤細胞的殺傷作用；從食管癌細胞膜上分離MHC-I類抗原肽，經(jīng)與HSP70-PCs混合后，誘導CTL，檢測對腫瘤細胞的殺傷作用； 5. HSP70-PCs對免疫細胞的作用

7、： 將HSP70-PCs、MHC-I類抗原肽分別負載DCs組，與T細胞共孵育，7天后取培養(yǎng)液上清，檢測培養(yǎng)液上清中細胞因子的溶解殺傷腫瘤細胞的作用；MTT法檢測共孵育7天的T淋巴細胞的增殖程度： 6. 統(tǒng)計學處理： 實驗中各組至少設三個復孔，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(X±s)表示，兩組間比較利用Student-t檢驗，多個組間比較用方差分析(AVONA)，檢驗水準α：0．05。 結果 1．細胞經(jīng)熱休克

8、作用后，形態(tài)學上有明顯變化；經(jīng)親和層析柱過柱、洗脫后得到的蛋白經(jīng)電泳鑒定為單一的蛋白； 2．HSP70-PCs誘導的CTL對食管癌細胞具的殺傷率為(37．79士7．54)％，對胃癌細胞和肝癌細胞的殺傷率分別為(19．52+3．70)％和(9．92+1．60)％，對食管癌細胞的殺傷率明顯高于對胃癌細胞和肝癌細胞的殺傷率(P<0．05)； 3．負載HSP70-PCs的DCs誘導的CTL對食管癌細胞是殺傷率為(58．36±3．

9、17)％，對胃癌細胞和肝癌細胞的殺傷率分別為(29．85+2．97)％和(17．54+2．55)％，對食管癌細胞的殺傷率明顯高于對胃癌細胞和肝癌細胞的殺傷率(／><0．05)；HSP70-PCs與MHC-I類分子相關肽混合物誘導的CTL對食管癌細胞的殺傷率為(43．68~7．80)％，對胃癌細胞和肝癌細胞的殺傷率分別為(27．47+2．99)％和(9．52+0．79)％，對食管癌細胞的殺傷率明顯高于對胃癌細胞和肝癌細胞的殺傷率(P<0．

10、05)；負載HSP70-PCs的DCs誘導的CTL對食管癌細胞是殺傷率明顯高于HSP70-PCs誘導的CTL和HSP70-PCs與MHC-I類分子相關肽混合物誘導的CTL對食管癌細胞的殺傷率(P<0．05)； 4．HSP70-PCs負載DCs后與T細胞共培養(yǎng)的上清液對食管癌細胞的溶解殺傷率為(10．114-1．30)％，對照組上清液對食管癌細胞的殺傷率為(1．77+0．31)％，兩者比較有明顯差異(P<0．05)； 5．

11、HSP70-PCs負載DCs組對T淋巴細胞的刺激增殖指數(shù)在DC：T=I：40時為SI=I．95±O．18，在時，刺激增殖指數(shù)分別為1．40±0.13和1．28士O．19，均明顯高于對照組(P<0．05)；且在1：40時刺激增殖能力高于1：20和1：100兩組(P<0．05)。 結論 1．利用親和層析法從熱休克處理過的食管癌細胞株上分離出的HSP70-PCs具有特異性的抗腫瘤作用； 2．HSP70-PCs聯(lián)合DC能