stTRAIl-納米金復(fù)合物促進(jìn)熱休克肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　利用化學(xué)還原法制備了聚乙烯亞胺修飾的納米金基因載體并研究其理化性質(zhì)、表征參數(shù)及細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)靜電吸附作用將納米金基因載體與含stTRAIL目的基因片段的重組質(zhì)粒DNA按一定質(zhì)量比結(jié)合構(gòu)建了stTRAIL-納米金復(fù)合物，并應(yīng)用該復(fù)合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細(xì)胞，觀察其對(duì)熱休克肝癌細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞凋亡等的影響，并探討stTRAIL-納米金復(fù)合物促進(jìn)熱休克肝癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.利

2、用化學(xué)還原法制備聚乙烯亞胺修飾的納米金基因載體，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)納米金顆粒的吸收光譜及最大吸收峰處波長(zhǎng)，在透射電鏡下觀察納米金顆粒的表觀形貌特征，用激光粒度儀檢測(cè)納米金顆粒的粒徑大小及其分布，用表面電位儀檢測(cè)納米金顆粒的表面電位（Zeta電位），用1％的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)納米金基因載體與質(zhì)粒DNA的結(jié)合穩(wěn)定性，CCK-8試劑盒檢測(cè)聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體及DNA-納米金復(fù)合物對(duì)HEK293細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，通過(guò)熒光顯微鏡觀

3、察聚乙烯亞胺納米基因載體介導(dǎo)pAcGFP-N1在體外培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞中的表達(dá)，并分析其轉(zhuǎn)染效率。
　　2.將納米金基因載體與含stTRAIL目的基因片段的重組質(zhì)粒DNA按不同質(zhì)量比混合，1％瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)stTRAIL-納米金復(fù)合物結(jié)合的穩(wěn)定性，CCK-8試劑盒檢測(cè)其對(duì)SMMC7721細(xì)胞的細(xì)胞毒性，確定納米金與重組質(zhì)粒DNA結(jié)合的最佳質(zhì)量比。stTRAIL-納米金復(fù)合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細(xì)胞后，用CCK-8試劑盒檢

4、測(cè)其對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721的增殖活性的影響，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該復(fù)合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細(xì)胞后促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　3.Real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)TRAIL信號(hào)通路下游Caspase-8、Caspase-3的mRNA、蛋白質(zhì)水平的表達(dá)差異，探討stTRAIL-納米金復(fù)合物促進(jìn)熱休克肝癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.聚乙烯亞胺還原氯金酸可以得到表面帶正電荷的納米金

5、顆粒，呈單分散球形分布，其粒徑為12.3±3.3 nm。在PH=7.2時(shí)，Zeta電位為+（29.7±5.1）mV。1％瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)納米金/質(zhì)粒DNA≥0.5時(shí)，質(zhì)粒DNA可完全結(jié)合到納米金表面。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體能介導(dǎo)pAcGFP-N1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)25％。
　　2.瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)納米金/質(zhì)粒DNA≥0.5時(shí)，重組質(zhì)粒DNA

6、可完全結(jié)合到納米金顆粒表面。CCK-8試驗(yàn)表明，納米金與重組質(zhì)粒DNA按質(zhì)量比5∶1結(jié)合時(shí)形成的復(fù)合物相對(duì)穩(wěn)定，且對(duì)細(xì)胞毒性較弱，最適合轉(zhuǎn)染stTRAIL基因。用按此比例結(jié)合的stTRAIL-納米金復(fù)合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細(xì)胞，能明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖活性，顯著地促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。
　　3.Real-time PCR結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)stTRAIL-納米金復(fù)合物聯(lián)合熱休克處理的肝癌細(xì)胞組，TRAIL信號(hào)通路下游Caspase-8、Cas

7、pase-3的mRNA表達(dá)明顯增高。Westernblot結(jié)果同樣表明，實(shí)驗(yàn)組TRAIL信號(hào)信號(hào)通路下游Caspase-8、Caspase-3等蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)化學(xué)合成的納米金基因載體具備制備簡(jiǎn)便、成本低、轉(zhuǎn)染效率較高的特點(diǎn)。
　　2.stTRAIL-納米金復(fù)合物按質(zhì)量比5∶1結(jié)合較穩(wěn)定，能夠轉(zhuǎn)染stTRAIL基因。該復(fù)合物能夠在熱休克條件下能夠顯著地抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。