支架蛋白IQGAP1對人食管癌細胞血管生成的影響及其機制的研究.pdf

1、目的：
　　1.構(gòu)建IQGAP1基因過表達和基因干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系及其對照細胞系。
　　2.通過體內(nèi)外實驗分別檢測IQGAP1基因?qū)ρ苌傻挠绊憽?br>　　3.研究IQGAP1對血管生成影響的分子機制。
　　方法：
　　1.利用Lipofectamine2000將綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）標記的IQGAP1過表達質(zhì)粒和它所對應的對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到人食管癌細胞EC

2、9706，用G418耐藥單克隆細胞的篩選方法，等到穩(wěn)定生長后，熒光顯微鏡下觀察其細胞定位，并通過Western blot檢測GFP-IQGAP1融合蛋白的表達，確定IQGAP1過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系是否構(gòu)建成功。
　　2.利用Lipofectamine2000將IQGAP1干擾質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進人食管癌細胞KYSE150內(nèi)，采用G418篩選耐藥克隆，待其穩(wěn)定生長后，熒光顯微鏡下觀察KYSE150細胞GFP的表達，并通過Wester

3、n blot檢測對照組與干擾組IQGAP1蛋白的表達情況，確定IQGAP1干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系是否構(gòu)建成功。
　　3.分別通過體外 HUVECs小管形成實驗和體內(nèi)的雞胚尿囊膜實驗來檢測IQGAP1基因表達對腫瘤血管生成的影響。
　　4.采用 Western blot技術(shù)研究 IQGAP1對食管癌細胞中 VEGFA與其受體VEGFR2、p-VEGFR2血管生成相關因子表達的影響。
　　5.通過Western blot技術(shù)研究

4、IQGAP1對Akt和ERK活化的影響。
　　6.在IQGAP1過表達組細胞中加入Akt和ERK抑制劑進行干預處理后，觀察抑制劑對VEGFA和p-VEGFR2蛋白表達的影響及對血管生成的影響。
　　結(jié)果：
　　1.熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染含GFP-IQGAP1重組質(zhì)粒的EC9706細胞中觀察到其為胞質(zhì)定位； Western blot結(jié)果顯示，在IQGAP1過表達細胞中有GFP-IQGAP1融合蛋白的表達，而在其對照

5、組內(nèi)則沒有，說明IQGAP1過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系已構(gòu)建成功。
　　2.在熒光顯微鏡下可觀察到， GFP在轉(zhuǎn)染IQGAP1干擾質(zhì)粒及對照質(zhì)粒的KYSE150細胞中為全細胞定位；對支架蛋白IQGAP1在干擾組細胞內(nèi)的表達量與其在對照組細胞內(nèi)的表達量通過Western blot進行比較，發(fā)現(xiàn)其表達量顯著降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.0001）。
　　3.體外HUVECs小管形成的實驗結(jié)果顯示，與對照組相比較，IQGAP1過表達組小管生

6、成數(shù)更多，而且所生成小管的管腔結(jié)構(gòu)更加完整，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0001），表明IQGAP1過表達在體外可以促進血管的生成；體內(nèi)雞胚尿囊膜的實驗結(jié)果也顯示，IQGAP1過表達組生成的血管數(shù)量較對照組多，并且所生成血管的形態(tài)舒展，顏色較為鮮紅，經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），說明IQGAP1過表達可以促進體內(nèi)血管的生成；體內(nèi)外實驗結(jié)果一致，表明IQGAP1過表達后會促進腫瘤血管的生成。
　　4. IQGA

7、P1干擾組采用體外HUVECs小管生成實驗，結(jié)果顯示，與對照組相比較，發(fā)現(xiàn)IQGAP1基因干擾后小管生成數(shù)較少，生成小管的管腔結(jié)構(gòu)也不完整，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0001），表明IQGAP1干擾后在體外可以抑制血管的生成；體內(nèi)雞胚尿囊膜實驗結(jié)果顯示，IQGAP1基因干擾后所生成的血管數(shù)量較對照組少，生成的血管色澤灰暗并且主血管較少，經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計得，兩者之間的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；上述體內(nèi)外實驗結(jié)果一致，表明干擾IQGAP

8、1基因表達后能夠明顯抑制腫瘤的血管生成。
　　5.在IQGAP1過表達的細胞中，經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，VEGFA與p-VEGFR2蛋白表達量與其在對照細胞內(nèi)的表達量相比都升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0001），而VEGFR2蛋白的表達量則在IQGAP1過表達組與其對照組細胞中無明顯差異，表明IQGAP1可能通過VEGFA與VEGFR2相互作用后促進VEGFR2發(fā)生磷酸化，進而促進血管的生成。
　　6.在IQ

9、GAP1干擾組細胞中，經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，VEGFA與p-VEGFR2蛋白的表達量與其在對照細胞內(nèi)相比，表達量都降低，差異有統(tǒng)計學方面的意義（P<0.0001），而VEGFR2的表達量則在IQGAP1干擾組與其對照組中無明顯差異，表明IQGAP1可能通過阻斷了VEGFA與其受體VEGFR2的相互作用進而抑制血管生成的過程。
　　7.經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，IQGAP1過表達組細胞中p-Akt、 p-ER

10、K蛋白的表達量與其在對照組的結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)兩者的表達量都升高，差異有統(tǒng)計學的意義（P<0.0001）；而IQGAP1干擾組細胞p-Akt、 p-ERK的表達量均低于其在對照組內(nèi)的表達量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0001）；說明IQGAP1對腫瘤細胞血管生成的發(fā)生機制的調(diào)控可能通過活化Akt和ERK信號通路發(fā)揮作用的。
　　8.在 IQGAP1過表達組細胞中加入Akt和 ERK抑制劑干預后， VEGFA和p-VEGFR2蛋白的表達

11、量顯著降低，并且經(jīng)抑制劑干預后血管生成數(shù)也降低，說明IQGAP1可能通過AKT或ERK/VEGFA-VEGFR2信號通路來影響腫瘤血管生成。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了IQGAP1過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系及IQGAP1干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。
　　2. IQGAP1過表達可以促進體內(nèi)外腫瘤的血管生成，而干擾IQGAP1表達后則會有效的抑制腫瘤血管的生成。
　　3. IQGAP1對食管癌中血管生成的作用機制可能與VEGFA與