轉(zhuǎn)染IL-27基因的人胰腺癌細(xì)胞抗腫瘤活性研究.pdf

1、目的：腫瘤是嚴(yán)重影響人類健康的重大疾病之一，胰腺癌是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤，也是臨床預(yù)后最差的腫瘤之一，早期不易被發(fā)現(xiàn)，晚期常有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，尚缺乏理想的治療方法。近年來，生物治療已成為腫瘤治療的一種新模式，其中免疫基因治療是腫瘤生物治療的研究熱點(diǎn)，通過將不同免疫分子基因?qū)肽[瘤或免疫效應(yīng)細(xì)胞，使其在機(jī)體表達(dá)并分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡或通過增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能，以加速腫瘤的消退。白細(xì)胞介素27(IL-27)是2002年P(guān)flanz報(bào)道的

2、一種IL-6/IL-12家族細(xì)胞因子[1]，主要作用于固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞，發(fā)揮廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。除了在Th1反應(yīng)中起重要作用外，還具有抗感染、抗腫瘤、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)活性[2]，但有關(guān)IL-27的作用機(jī)理等許多問題還有待于進(jìn)一步研究。本研究將IL-27基因轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞(Aspc1)，建立荷瘤裸鼠模型，探討了IL-27的抗腫瘤作用機(jī)制。 方法： 1. IL-27基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立以逆轉(zhuǎn)錄病毒

3、為載體，將IL-27基因轉(zhuǎn)入人胰腺癌細(xì)胞(Aspc1)，同時(shí)，將LXSN空載體轉(zhuǎn)染Aspc1細(xì)胞作為對照組細(xì)胞，用G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 2. 用光學(xué)顯微鏡觀察Aspc1/IL-27、Aspc1/LXSN和Aspc1細(xì)胞的形態(tài)變化，RT-PCR檢測IL-27基因的表達(dá)，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-27的分泌。 3. IL-27誘導(dǎo)干擾素-γ(IFN-γ)的產(chǎn)生ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(h

4、uman peripheralblood mononuclear cells，hPBMCs)分泌IFN-γ和IL-4水平。 4. 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用MTT法檢測細(xì)胞Aspcl/IL-27、Aspcl/LXSN和Aspcl細(xì)胞的體外增殖反應(yīng)能力，繪制生長曲線。 5. 用流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同Aspcl細(xì)胞表面分子CD80、CD86和MHCⅠ、MHCⅡ類分子的表達(dá)情況。 6. 動(dòng)物模型的建立將Aspcl/IL-27、Asp

5、cl/LXSN和Aspcl細(xì)胞接種于裸鼠皮下，觀察三組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性、生長情況和裸鼠的生存期，用RT-PCR方法來檢測裸鼠腫瘤組織中IL-27的表達(dá)，ELISA法檢測各組裸鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。 7. 細(xì)胞凋亡分析采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測Aspcl/IL-27細(xì)胞在體外和接種于裸鼠體內(nèi)的細(xì)胞凋亡情況，并用電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化。 8. Fas和Survivin的表達(dá)用RT-PCR法檢測Aspcl

6、/IL-27、Aspel/LXSN和Aspcl三組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)移植瘤組織中Fas和Survivin基因表達(dá)變化；采用Western-blot法來檢測其在蛋白水平表達(dá)變化。 結(jié)果： 1. 將IL-27和空載體LXSN基因分別轉(zhuǎn)染Aspcl細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，獲得表達(dá)IL-27的陽性細(xì)胞克隆Aspcl/IL-27和空載體對照細(xì)胞Aspcl/LXSN。光鏡下觀察轉(zhuǎn)染IL-27基因后的Aspcl/IL-27細(xì)胞與野生型Asp

7、cl和Aspel/LXSN細(xì)胞形態(tài)學(xué)無明顯變化；RT-PCR分析結(jié)果顯示，Aspcl/IL-27細(xì)胞有IL-27p28和IL-27EBI3基因的表達(dá)；ELISA檢測結(jié)果顯示，Aspc1/IL-27細(xì)胞培養(yǎng)上清中可檢測出高水平IL-27，而Aspc1/LXSN和Aspc1細(xì)胞未見IL-27表達(dá)。從而在基因和蛋白水平證明，成功建立了轉(zhuǎn)染IL-27基因的人胰腺癌細(xì)胞株。 2. Aspc1/IL-27細(xì)胞培養(yǎng)上清可刺激hPBMCs產(chǎn)生I

8、FN-γ，IFN-γ水平明顯高于Aspc1/LXSN和Aspc1細(xì)胞(P<0.01)，然而，IL-4水平在三種細(xì)胞間無顯著變化(P＞0.05)。 3. Aspc1/IL-27細(xì)胞的體外增殖反應(yīng)與Aspc1/LXSN和Aspc1細(xì)胞無明顯差別(P＞0.05)。 4. Aspc1/IL-27、Aspc1/LXSN、Aspc1細(xì)胞表面CD80、CD86和MHCⅠ類、MHCⅡ類分子的表達(dá)水平無顯著性差異(P＞0.05)。

9、 5. Aspc1/IL-27細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長速度較Aspc1和Aspc1/LXSN細(xì)胞明顯減慢(P<0.01)，且接種Aspc1/IL-27細(xì)胞組裸鼠的生存期也明顯長于接種Aspc1/LXSN和Aspc1細(xì)胞組(P<0.01)。接種Aspc1/IL-27細(xì)胞組裸鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ水平明顯高于接種Aspc1/LXSN和Aspc1細(xì)胞組(P<0.01)。 6. Aspc1/IL-27、Aspc1/LXSN、Aspc1三種細(xì)

10、胞的體外凋亡率無明顯差異(P＞0.05)；而在接種裸鼠后，Aspc1/IL-27移植瘤組織細(xì)胞的凋亡率明顯高于Aspc1/LXSN和Aspc1細(xì)胞組(P<0.01)；電子顯微鏡下觀察，Aspc1/IL-27細(xì)胞移植瘤組織出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。 7. 接種Aspc1/IL-27細(xì)胞裸鼠移植瘤組織較接種Aspc1/LXSN與Aspc1細(xì)胞組Fas表達(dá)水平升高(P<0.01)，Survivin表達(dá)水平下降(P<0.01)。