IL-17基因轉染小鼠乳腺癌細胞4T1的建立及其抗腫瘤機制研究.pdf

1、目的:最近幾年,生物治療已成為一種新型的腫瘤治療方法,并越來越受到人們的重視。其中細胞因子基因治療是腫瘤生物治療的研究熱點,通過將不同的細胞因子基因導入腫瘤或免疫效應細胞,使其在機體表達來促進腫瘤細胞凋亡或者通過增強免疫系統(tǒng)功能以加速腫瘤的消退。IL-17是目前新發(fā)現(xiàn)的主要由CD4+記憶性T淋巴細胞,單核細胞等分泌的一種細胞因子,其在天然免疫和宿主防御中有特殊功能,在炎癥反應中對白細胞的遷移和活化、細胞增殖分化、生物因子轉錄與表達、免疫

2、調節(jié)及腫瘤生長方面發(fā)揮重要作用。但有關IL-17的作用機理等許多問題還有待于進一步研究。本實驗將構建表達IL-17基因的小鼠乳腺癌細胞株,建立荷瘤小鼠模型,研究IL-17基因的生物活性及其抗腫瘤效應。
　　 方法:1 IL-17基因轉染細胞株的建立采用脂質體轉染的方法將插入IL-17基因的pcDNA3.1載體導入小鼠乳腺癌細胞4T1,同時,將pcDNA3.1空載體轉染4T1細胞作為對照組細胞,經(jīng)G418篩選后獲得表達IL-17的

3、陽性細胞克隆(4T1/IL-17)。
　　 2用光學顯微鏡觀察4T1/IL-17、4T1/pcDNA3.1和4T1細胞的形態(tài)變化,RT-PCR檢測IL-17基因的表達,激光共聚焦和Western-blot法檢測IL-17蛋白的表達。
　　 3細胞增殖實驗MTS法分析4T1/IL-17細胞體外增殖反應,繪制生長曲線。流式細胞技術檢測細胞周期和凋亡率的變化以及細胞表面MHCI、MHCII、LFA-1等分子表達的情況。

4、　　 4 IL-17誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生IL-6 ELISA法檢測4T1/IL-17、4T1/pcDNA3.1和4T1細胞培養(yǎng)上清誘導RAW264.7細胞分泌IL-6水平。
　　 5建立荷瘤動物模型,將4T1/IL-17、4T1/pcDNA3.1和4T1細胞分別接種于小鼠右側背部皮下,觀察三種細胞移植瘤在小鼠體內成瘤性、生長情況及小鼠生存期的變化。接種腫瘤細胞6周后分別取三組小鼠脾臟和腫瘤組織,用乳酸脫氫酶法、

5、MTS法分別檢測三組小鼠脾細胞CTL殺傷活性、脾細胞增殖反應情況。用ELISA法檢測小鼠脾細胞經(jīng)刺激后產(chǎn)生IFN-γ、IL-12的情況;采用流式細胞技術檢測4T1/IL-17細胞接種于小鼠體內的細胞凋亡情況及腫瘤組織細胞表面MHCI、MHCII、LFA-1等分子表達的變化。
　　 結果:1以質粒pcDNA3.1為載體成功將IL-17基因轉染至小鼠乳腺癌細胞4T1,建立表達IL-17的細胞株4T1/IL-17,該細胞可產(chǎn)生和分泌I

6、L-17分子。光鏡下觀察三種細胞形態(tài)學無明顯變化;RT-PCR檢測結果顯示4T1/IL-17細胞有IL-17基因的表達,激光共聚焦顯微鏡和Western-blot分析結果證明,4T1/IL-17細胞中有IL-17蛋白表達,而4T1/pcDNA3.1和4T1細胞未見IL-17蛋白表達,從而在基因和蛋白水平證明,成功建立了轉染IL-17基因的小鼠乳腺癌細胞株。
　　 24T1/IL-17細胞培養(yǎng)上清可刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7

7、產(chǎn)生IL-6,IL-6水平明顯高于4T1/pcDNA3.1和4T1細胞培養(yǎng)上清的作用(P＜0.01)。
　　 34T1/IL-17細胞的體外增殖反應與4T1/pcDNA3.1和4T1細胞無明顯差別(P＞0.05)。轉染IL-17基因不影響細胞劇期和細胞凋亡,應用流式細胞技術檢測4T1/IL-17和4T1/pcDNA3.1細胞表面MHCI、MHCII、LFA-1的表達水平與4T1細胞相比沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　

8、 4將4T1/IL-17細胞接種小鼠體內后,荷瘤小鼠的腫瘤生長速度、體積和重量均明顯小于4T1/pcDNA3.1細胞組及4T1細胞組,生存時間也明顯延長(P＜0.05)。
　　 5與4T1/pcDNA3.1及4T1細胞組荷瘤小鼠相比,接種4T1/IL-17細胞組小鼠腫瘤細胞凋亡率明顯增高(P＜0.05)。接種4T1/IL-17細胞組小鼠腫瘤組織細胞表面MHCI、MHCII、LFA-1分子表達水平顯著性增高(P＜0.01)。

9、r>　　 6接種各組腫瘤細胞6周后,4T1/IL-17細胞組小鼠脾細胞的CTL殺傷活性及對ConA刺激的細胞增殖反應性均明顯高于接種4T1/pcDNA3.1及4T1細胞組(P＜0.01);此外,接種4T1/IL-17細胞組小鼠脾細胞可產(chǎn)生高水平的IFN-γ、IL-12,明顯高于接種4T1/pcDNA3.1及4T1細胞組,有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 結論:成功構建轉染IL-17基因的小鼠乳腺癌細胞株(4T1/IL-17