轉染IL-21結腸癌細胞瘤苗的制備及其抗腫瘤效應的初步研究.pdf

1、目的：IL-21是新近發(fā)現(xiàn)的Ⅰ類細胞因子。它可以通過調(diào)節(jié)機體的免疫力來對某些腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用。目前已成為腫瘤基因治療中一個新的候選目的基因。把IL-21基因轉染到鼠結腸癌細胞中構建重組細胞，將該細胞注射給裸鼠，結果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞生長緩慢，提示IL-21可以影響腫瘤細胞的生長。因此本研究擬用同位素Co60照射方法給予已成功轉染IL-21的Colon26細胞致死劑量的照射使其失去致瘤性，制備成仍保留有抗腫瘤活性的轉基因瘤苗。通過與未照射親

2、株細胞的對比，觀察其生物學性狀及抗腫瘤效應的差異。以期為今后結腸癌的基因治療提供理論依據(jù)。 方法：將Colon26/IL-21細胞給予50GyCo60同位素照射后制備成瘤苗；在光鏡下觀察照射前后Colon26/IL-21細胞形態(tài)學的改變；采用細胞計數(shù)法、MTT法測定出經(jīng)50GyCo60照射后Colon26/IL-21細胞瘤苗的生長情況并比較照射前后此細胞株的生長活力和細胞增殖的變化，并且在照射后的不同時間點采用RT-PCR的方法

3、檢測IL-21基因的轉錄情況、比較其在不同的時間點量的變化；采用流式細胞分析方法檢測經(jīng)50GyCo60照射后Colon26/IL-21細胞瘤苗的凋亡率、細胞周期改變、增殖活力情況；采用ELISA法測定Colon26/IL-21細胞、經(jīng)50GyCo60照射后Colon26/IL-21細胞瘤苗、經(jīng)50GyCo60照射后Colon26細胞與BALB/c小鼠脾細胞共培養(yǎng)其上清液中分泌的IFN-γ水平變化；將制備好的Colon26/IL-21細胞

4、瘤苗接種到同源基因BALB/c近交系小鼠腳墊連續(xù)觀察其致瘤性及抑制同源基因鼠結腸癌細胞腫瘤生長的作用。 結果：1通過用同位素Co60照射方法給予50Gy劑量于Colon26/IL-21細胞，采用細胞計數(shù)、MTT方法證明瘤苗的生長和增殖活力受到抑制，Colon26/IL-21細胞其倍增時間大約是2.1天，而照射后的Colon26/IL-21細胞經(jīng)過4天培養(yǎng)后其細胞數(shù)目減少了一半，此瘤苗在5天后只有大約50％的細胞保持代謝活力，7天

5、后只有大約30％細胞保持代謝活力；通過流式細胞技術方法測定實驗組(照射后的Colon26/IL-21細胞培養(yǎng)第4天)和對照組(Colon26/IL-21細胞)凋亡率、增殖指數(shù)、細胞周期分布，實驗組凋亡率、增殖指數(shù)為35.547±3.787％、20.579±4.860％較對照組0.734±0.115％、45.843±0.721％相比均有明顯顯著性差異(P＜0.01)，照射后實驗組的細胞產(chǎn)生明顯的G1期阻滯(G1期細胞百分比為79.421±

6、4.860％)，與對照組相比(G1期細胞百分比為54.157±0.721％)，有顯著性差異(P＜0.01)而實驗組S期細胞(S期細胞百分比為12.936±3.238％)與對照組(S期細胞百分比為31.271±0.757％)相比顯著減少、并且有顯著性差異(P＜0.01)；通過RT-PCR的方法檢測Colon26/IL-21細胞瘤苗IL-21基因在第1、3、5天時仍然還有轉錄產(chǎn)物并且其量呈遞減趨勢；通過此三方面的證據(jù)可以說明照射后的Colo

7、n26/IL-21細胞增殖受到抑制，50％的細胞在4天后仍然有代謝活性，其目的基因IL-21仍然有轉錄。接種1×106個照射后的Colon26/IL-21細胞瘤苗細胞于實驗組小鼠腳墊，7天后觀察局部無腫瘤細胞生長的跡象、連續(xù)觀察45天局部未見腫瘤細胞生長。 2制備成Colon26/IL-21細胞瘤苗后將瘤苗的抗腫瘤具體效應分為體內(nèi)、體外兩方面：(1)不同刺激原作用下，小鼠脾細胞共培養(yǎng)其上清液中IFN-γ平均含量。實驗中證明Col

8、on26/IL-21細胞與小鼠脾細胞共培養(yǎng)其上清液中IFN-γ平均含量為23.767±3.123pg/ml，照射后的Colon26/IL-21細胞與小鼠脾細胞共培養(yǎng)其上清液中IFN-γ平均含量為21.930±2.386pg/ml，兩者比較無明顯顯著性差異(P＞0.05)。照射后的Colon26細胞與小鼠脾細胞共培養(yǎng)其上清液中IFN-γ平均含量為10.900±1.224pg/ml，與前兩者比較有明顯顯著性差異(P＜0.01)；(2)體內(nèi)動

9、物實驗中證明：接種5×103個Colon26細胞于實驗組和對照組小鼠腳墊，自接種后的第3天開始每隔4天繼續(xù)向實驗組小鼠背部接種1×105個照射后的Colon26/IL-21細胞瘤苗1次，共追加5次。連續(xù)觀察實驗組和對照組小鼠腳墊局部成瘤效果。結果顯示對照組小鼠腳墊在接種5×103個Colon26細胞后的第7天局部腫瘤細胞開始生長，而實驗組小鼠在第7天局部也同時出現(xiàn)腫瘤細胞生長跡象，第26天觀察小鼠局部腫瘤細胞生長狀況發(fā)現(xiàn)對照組小鼠局部腫

10、瘤平均體積為8.270±1.372cm3而實驗組小鼠局部腫瘤平均體積為7.963±1.115cm3，兩者比較無顯著性差異(P＞0.05)。接種5×103個Colon26細胞于實驗組和對照組小鼠腳墊，自接種后的第3天開始每隔4天繼續(xù)向實驗組小鼠背部接種2×106個照射后的Colon26/IL-21細胞瘤苗1次，共追加5次。連續(xù)觀察實驗組和對照組小鼠腳墊局部成瘤效果。結果顯示對照組小鼠腳墊在接種5×103個Colon26細胞后的第7天局部腫

11、瘤細胞開始生長，而實驗組小鼠在第7天局部也同時出現(xiàn)腫瘤細胞生長，第26天觀察小鼠局部腫瘤生長狀況發(fā)現(xiàn)對照組小鼠局部腫瘤平均體積為8.032±1.595cm3而實驗組小鼠局部腫瘤平均體積為1.887±0.529cm3，兩者比較有顯著性差異(P＜0.01)具體計算其抑瘤率為76.51％。 結論：1經(jīng)過50GyCo60照射Colon26/IL-21細胞后，與其親代細胞相比增殖指數(shù)下降、凋亡率上升，出現(xiàn)了明顯的G1期阻滯。在照射后體外培

12、養(yǎng)的過程中其目的基因IL-21仍然有轉錄，但是轉錄產(chǎn)物的量呈遞減趨勢，表明在照射后其內(nèi)部基因的轉錄會隨著細胞周期的改變、凋亡率的上升而逐漸減少。2連續(xù)觀察制備的Colon26/IL-21細胞瘤苗在體外動物實驗中不具有致瘤性。3體外實驗證明照射后的Colon26/IL-21細胞瘤苗可以在體外刺激BALB/c小鼠脾細胞，其產(chǎn)生IFN-γ的量較未照射的Colon26/IL-21細胞沒有明顯差別。4皮下接種Colon26/IL-21細胞瘤苗可以