小鼠dsNKG2D-IL-21融合蛋白的制備及其抗結(jié)腸癌移植瘤活性的分析.pdf

1、dsNKG2D-IL-21蛋白是由兩個NKG2D胞外區(qū)和IL-21構(gòu)成的融合蛋白，是利用NKG2D可靶向識別許多腫瘤細(xì)胞表面MICA分子的優(yōu)勢，并結(jié)合IL-21能夠促進(jìn)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞功能的特點(diǎn)，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。結(jié)腸癌是結(jié)腸粘膜上皮的惡性腫瘤，盡管常規(guī)手術(shù)治療或術(shù)后化療能夠緩解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但仍存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的難題。鑒于課題組前期已制備小鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白，并證實(shí)了其在體外能夠有效地增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能并在

2、體內(nèi)能夠顯著抑制結(jié)腸癌腫瘤生長，而IL-21與IL-15結(jié)構(gòu)上具有高度同源性，抗腫瘤功能更為顯著，為尋找更合適的抗腫瘤因子，本課題制備小鼠來源的dsNKG2D-IL-21融合蛋白，通過體外實(shí)驗(yàn)初步觀察該蛋白是否增強(qiáng)NK和CD8+T細(xì)胞的功能，且基于結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型，觀察其是否具備抑制腫瘤生長的活性。
　　目的:為了研究人dsNKG2D-IL-21融合蛋白的體內(nèi)抗腫瘤活性，本課題試圖利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備同源的小鼠雙可溶性NKG2D

3、(dsNKG2D)與IL-21的融合蛋白（即mdsNKG2D-IL-21融合蛋白），并體外和體內(nèi)觀察其對NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及體內(nèi)抗結(jié)腸癌腫瘤效應(yīng)，從而為進(jìn)一步分析人dsNKG2D-IL-21融合蛋白體內(nèi)抗腫瘤活性提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　(1)制備并鑒定小鼠dsNKG2D-IL-21融合蛋白
　　首先，取課題組前期已構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28 a-dsNKG2D-IL-15，以限制性內(nèi)切酶

4、切去IL-15片段。以pGEMT為載體，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出小鼠IL-21基因片段，將IL-21片段插入pET28a-dsNKG2D載體，得到重組的pET28a-dsNKG2D-IL-21原核表達(dá)載體。將pET28a-dsNKG2D-IL-21重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21菌株，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得包涵體，洗滌包涵體后，純化并復(fù)性，獲得鼠dsNKG2D-IL-21重組融合蛋白(mdsNKG2D-IL21)?；贜KG2D抗體和I

5、L-21抗體，以酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)和Western Blot法分別鑒定mdsNKG2D-IL-21融合蛋白內(nèi)NKG2D及IL-21的結(jié)構(gòu)域;其次利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析mdsNKG2D-IL-21融合蛋白與表達(dá)RAE的YAC細(xì)胞株的結(jié)合能力，并以不表達(dá)RAE-1的Ba/F3細(xì)胞株作為陰性對照。
　　(2)小鼠dsNKG2D-IL-21融合蛋白對NK、CD8+T細(xì)胞功能的影響及其抗結(jié)腸癌活性分析
　　取自行制備的

6、mdsNKG2D-IL-21融合蛋白，體外刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞過夜，標(biāo)記抗體后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析，檢測NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面CD69和CD107a的表達(dá)，胞內(nèi)染色檢測NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ、穿孔素和顆粒酶B的情況;此外，取該融合蛋白進(jìn)行體內(nèi)刺激，給小鼠腹腔注射mdsNKG2D-IL-21融合蛋白，24 h后同以上方法檢測NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的頻率改變及活化狀態(tài)。
　　取預(yù)先培養(yǎng)到對數(shù)期的CT-2

7、6細(xì)胞，給BALB/c小鼠背部皮膚進(jìn)行皮下接種荷瘤，在成瘤第7d，將小鼠隨機(jī)分2組，分別注射PBS（陰性對照）、mdsNKG2D-IL-21蛋白（實(shí)驗(yàn)組），持續(xù)三周，期間每天觀察小鼠腫瘤生長情況并做好記錄，21d后處死小鼠，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析荷瘤小鼠脾臟中NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的頻率及活化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　(1)構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET28a-mdsNKG2D-IL-21中NKG2D與IL-21序列均與Genb

8、ank中的標(biāo)準(zhǔn)序列一致，經(jīng)誘導(dǎo)在大腸桿菌(BL21)中可獲得有效表達(dá)，復(fù)性后mdsNKG2D-IL-21融合蛋白與NKG2D及IL-21抗體均可特異性結(jié)合，并能與NKG2D配體(RAE-1)陽性的腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
　　(2)在體外或體內(nèi)，mdsNKG2D-IL-21融合蛋白均可促進(jìn)NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD69，上調(diào)NK細(xì)胞表達(dá)CD107a、顆粒酶B和穿孔素，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ，從而促進(jìn)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的

9、細(xì)胞毒活性及增殖。
　　對荷瘤小鼠分析顯示，相比于PBS治療組，mdsNKG2D-IL-21融合蛋白治療組能夠有效抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長，且荷瘤小鼠脾臟中表達(dá)CD69、顆粒酶B及穿孔素的NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞的頻率顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:制備了小鼠dsNKG2D-IL-21重組融合蛋白，該蛋白能夠刺激NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化，并增強(qiáng)其細(xì)胞毒活性;體內(nèi)使用具有抑制結(jié)腸癌移植瘤生長的效應(yīng)，最終為人dsNKG