B16F10-ESAT-6-gpi-IL-21腫瘤干細(xì)胞疫苗的制備及其抗腫瘤效應(yīng)的研究.pdf

1、惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)簡(jiǎn)稱(chēng)惡黑，是一種惡性程度極高的皮膚腫瘤，多發(fā)生于皮膚體表，占皮膚惡性腫瘤的7％～20％，可轉(zhuǎn)移至肺和腦等部位。近年來(lái)惡黑發(fā)病率，死亡率呈不斷上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡也愈來(lái)愈早，且極易擴(kuò)散，復(fù)發(fā)率高，受到人們重視。目前，針對(duì)惡黑的治療手段包括手術(shù)、放療、化療、免疫治療等，但是由于部分黑色素瘤細(xì)胞對(duì)放療、化療的抵抗，造成黑色素瘤的復(fù)發(fā)，成為徹底清除腫瘤的最大障礙。因此尋找新的治療途徑已成為

2、提高惡黑患者生存率的關(guān)鍵。
　　以免疫治療為主的生物治療已經(jīng)發(fā)展成為腫瘤治療的新模式。免疫治療一般包括:細(xì)胞因子治療、過(guò)繼性免疫治療、腫瘤疫苗、抗體為基礎(chǔ)的免疫治療、分子靶向治療等。其中腫瘤的治療性疫苗，尤其是腫瘤細(xì)胞疫苗、基因工程疫苗等都取得了可喜的進(jìn)展。疫苗能夠激活機(jī)體的自然殺傷細(xì)胞(NK)和特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，產(chǎn)生抗腫瘤的保護(hù)性免疫應(yīng)答作用，有著廣闊的應(yīng)用前景。但由于腫瘤抗原免疫原性弱、腫瘤免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜、腫瘤

3、的異質(zhì)性等原因，疫苗的實(shí)際療效與預(yù)期有很大差距，如何提高腫瘤疫苗免疫原性，激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)對(duì)瘤細(xì)胞免疫攻擊效應(yīng)已成為研究?jī)?nèi)容之一。
　　以整個(gè)腫瘤細(xì)胞作為抗原來(lái)源是腫瘤疫苗發(fā)展趨勢(shì)之一，具有不需鑒定其腫瘤特異性抗原的優(yōu)點(diǎn)，但其免疫原性弱、特異性差，因此需要人為的改變其免疫原性或以細(xì)胞因子為佐劑，改變接種部位微環(huán)境，激活抗原提呈細(xì)胞(APC)，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。本課題組前期的部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:向小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞導(dǎo)入糖基化磷脂

4、酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)修飾的6kD結(jié)核桿菌早期分泌靶抗原(6kD earlysecretary antigenic target，ESAT-6)和白細(xì)胞介素-21(IL-21)基因制成的瘤苗，膜表達(dá)強(qiáng)免疫原性的“異種抗原”ESAT-6，打破機(jī)體的免疫耐受，誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性的免疫應(yīng)答，而分泌表達(dá)的IL-21作為免疫佐劑可增強(qiáng)荷瘤鼠NK、CTL抗腫瘤活性，兩者分別以不同機(jī)制發(fā)揮誘導(dǎo)抗

5、腫瘤免疫應(yīng)答，但這種效應(yīng)對(duì)腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)作用如何仍有待研究。
　　CSCs是腫瘤中具有干細(xì)胞特性的一類(lèi)細(xì)胞，既具備高度增殖能力與自我更新能力，也具備多向分化潛能的細(xì)胞，這部分細(xì)胞雖只占少部分，但卻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞，對(duì)惡性腫瘤的治愈有著深遠(yuǎn)的意義。CSCs做為抗腫瘤研究的靶細(xì)胞，近幾年來(lái)對(duì)其研究在不斷深入，如用CSCs聯(lián)合樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)免疫小鼠后，能拮抗野生型腫瘤細(xì)胞的攻擊，

6、表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效果。
　　本研究選擇小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10細(xì)胞，將構(gòu)建好的pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。然后從中分選出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+ CSCs免疫C57BL6小鼠，研究其免疫效應(yīng)與拮抗腫瘤效應(yīng)。
　　目的:
　　探討表達(dá)ESAT-6-gpi和IL-21的黑色素瘤B16F10 CD133+CD

7、44+ CSCs瘤苗抗腫瘤效應(yīng)，為以CSCs瘤苗治療黑色素瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞，并通過(guò)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。用免疫熒光和Western blot分別檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株ESAT-6和gpi/IL-21在細(xì)胞膜表面的表達(dá)。
　　2.將單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21細(xì)胞，利用免

8、疫磁珠分選技術(shù)分離出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+ CSCs，以5×105個(gè)經(jīng)絲裂霉素滅活的細(xì)胞免疫C57BL/6小鼠，共免疫三次，每次間隔14天，末次免疫后10天，以5×105 B16F10野生型細(xì)胞攻擊免疫鼠。同時(shí)設(shè)B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133-CD44-細(xì)胞、B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21細(xì)胞和B16F10 CD133+CD44+ CSCs為對(duì)照

9、，以上述同樣方法免疫和攻擊小鼠。
　　3.觀察各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，并通過(guò)檢測(cè)免疫小鼠血清細(xì)胞因子，補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒活性(CDC)、脾細(xì)胞、NK細(xì)胞毒活性以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)，比較CSCs瘤苗與普通瘤苗的抗腫瘤效果差異。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)免疫熒光和Western Blot檢測(cè)，證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21膜表達(dá)異種抗原ESAT-6，并且分泌表達(dá)IL-21，且瘤苗免

10、疫小鼠血清中檢測(cè)到ESAT-6抗體。
　　2.用免疫磁珠分選技術(shù)分選出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+ CSCs細(xì)胞，免疫C57BL6小鼠后，B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+ CSCs瘤苗免疫小鼠成瘤率，腫瘤體積，腫瘤生長(zhǎng)速度均較普通瘤苗低，差異均有顯著性意義，(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21

11、CD133+CD44+ CSCs瘤苗免疫組小鼠血清IFN-γ水平，CDC、脾細(xì)胞及NK細(xì)胞毒活性均較普通瘤苗高，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 CSCs瘤苗免疫組小鼠腫瘤組織中EMT相關(guān)蛋白即E-鈣黏著蛋白高表達(dá)，波形蛋白低表達(dá)，差異有顯著性意義，(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　本研究制備出基因修飾的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+ CSCs瘤苗，能有效的誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫