重組噬菌體疫苗的構(gòu)建及其抗腫瘤效應(yīng)的初步研究.pdf

1、第一部分：KDR基因重組噬菌體疫苗的構(gòu)建及抗腫瘤效應(yīng)的初步研究 背景和目的：腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴新生血管的生成,VEGF及其受體VEGFR系統(tǒng)在腫瘤新生血管生成過程中起了主導(dǎo)作用，利用主動免疫打破對自身抗原(與血管形成相關(guān))的免疫耐受是目前腫瘤治療的一個熱點(diǎn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞基因穩(wěn)定，不存在MHCⅠ和MHCⅡ抗原的下調(diào)，以血管內(nèi)皮生長因子受體為靶點(diǎn)有別于傳統(tǒng)的腫瘤疫苗，KDR是介導(dǎo)VEGF在腫瘤新生血管形成中發(fā)揮功能的主要受體，KD

2、R與VEGF的親和力雖然較弱，而其酪氨酸激酶活性很強(qiáng)，在VEGF介導(dǎo)的血管形成特性中，如促有絲分裂作用，化學(xué)趨化作用，誘導(dǎo)形態(tài)改變起主要作用，其特點(diǎn)決定了KDR是腫瘤抗血管治療的一個重要靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)以T7噬菌體為載體，構(gòu)建KDR基因重組的噬菌體疫苗，探討其對C57BL/6J純系小鼠Lewis肺癌模型上的抗腫瘤效果。 結(jié)果：人肺癌組織cDNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)目標(biāo)條帶位置正確，從轉(zhuǎn)化的克隆株中挑取陽性克隆，經(jīng)

3、質(zhì)粒提取和測序，確認(rèn)KDR膜外區(qū)基因克隆成功。以亞克隆引物(PrimerⅡ)PCR擴(kuò)增目標(biāo)重組片段，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)帶位置與預(yù)期吻合。T7-KDR基因組經(jīng)Up-Down引物以及測序鑒定，證實(shí)亞克隆片斷被成功克隆到T7噬菌體基因組中，經(jīng)SDS-PAGE及WesternBlot抗原性檢測，確認(rèn)P10B融合蛋白的表達(dá)情況及其KDR抗原性，重組噬菌體疫苗構(gòu)建成功。各實(shí)驗(yàn)組免疫后，T7-KDR免疫組抑制程度明顯，潛伏期短，腫瘤生長速

4、度最慢，腫瘤重量與NS組和PC組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，PC組與NS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.05)。小鼠血清稀釋至1：1000，特異性抗KDR抗體仍呈陽性。結(jié)論：成功構(gòu)建了KDR基因重組T7噬菌體疫苗，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了特異性抗KDR抗體，該噬菌體疫苗對小鼠Lewis肺癌具有明顯的抗腫瘤作用，用人源KDR作為免疫原免疫小鼠通過免疫交叉反應(yīng)可以打破對自身抗原的免疫耐受，產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)研究為腫瘤的免疫治療和研究提

5、供了新的思路和方法，T7噬菌體作為表達(dá)載體也可應(yīng)用于其他腫瘤生長相關(guān)的因子和受體構(gòu)建基因重組疫苗。 第二部分：異種血管內(nèi)皮生長因子基因重組T7噬菌體疫苗對小鼠Lewis肺癌的抑制作用 背景與目的：腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成有密切關(guān)系，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是作用最強(qiáng)、特異性最高的調(diào)控因子，因此成為抗腫瘤血管新生的良好靶點(diǎn)。腫瘤疫苗是癌癥治療與研

6、究很有潛力的途徑。噬菌體疫苗屬于病毒載體疫苗，并兼有蛋白疫苗和DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)，在抗腫瘤研究中有良好應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)制備人VEGFl65基因重組T7噬菌體疫苗，檢測其VEGF抗原性，并初步觀察其誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性抗VEGF抗體在C57BL/6J純系小鼠Lewis肺癌模型上的抗腫瘤效果。 結(jié)論：初步建立了VEGF基因重組噬菌體疫苗的開發(fā)平臺。成功構(gòu)建了VEGF基因重組T7噬菌體疫苗，該疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性抗體在一定程度上抑制了Lew

7、is腫瘤的生長。以異種同源蛋白質(zhì)作為免疫原能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 第三部分：表達(dá)EGFR的噬菌體疫苗對小鼠異位移植腫瘤的免疫治療 背景與目的：國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)人類許多惡性腫瘤細(xì)胞都有表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)的表達(dá)增強(qiáng)和自分泌表皮生長因子類的能力，并通過自分泌或旁分泌機(jī)制促進(jìn)腫瘤生長，因此成為腫瘤的分子靶向治療的熱點(diǎn)。以噬菌體為載體制備腫瘤疫苗屬于病毒載體疫苗

8、，并兼有蛋白疫苗和DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)，在抗腫瘤研究中有良好應(yīng)用前景。制備5個表達(dá)雞源表皮生長因子受體(cEGFR)部分肽段的基因重組T7噬菌體疫苗，檢測其EGFR抗原性，并初步觀察其誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性抗EGFR抗體在C57BL/6J純系小鼠Lewis肺癌模型上的抗腫瘤效果。 結(jié)論：初步建立了EGFR基因重組噬菌體疫苗的開發(fā)平臺。成功構(gòu)建了5個cEGFR基因重組T7噬菌體疫苗，該疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性抗體在一定程度上抑制了EGFR陽性腫