EGFR基因重組噬菌體疫苗的構(gòu)建及抗腫瘤效應(yīng)的初步研究.pdf

1、目的：制備5個表達雞源表皮生長因子受體(cEGFR)部分肽段的基因重組T7噬菌體疫苗，檢測其EGFR抗原性，并初步觀察其誘導產(chǎn)生的內(nèi)源性抗EGFR抗體在C57BL/6J純系小鼠Lewis肺癌模型上的抗腫瘤效果。 方法：用RT-PCR方法從雞睪丸組織總RNA中克隆出EGFR膜外區(qū)基因片段，將其克隆到載體pMD18-TVector上，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，從陽性克隆中提取質(zhì)粒，對該基因片段進行測序。用DNAStar軟

2、件對基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)序列進行分析，選取親水性高、抗原性強的區(qū)段，設(shè)計5對引物，將PCR擴增的片段亞克隆到T7噬菌體上。經(jīng)篩選的5個肽段分別展示于其衣殼次要頭蛋白(P10B)上，構(gòu)建了5個cEGFR基因重組T7噬菌體疫苗。用該重組噬菌體侵染其宿主菌，液體擴增并純化出重組噬菌體疫苗。經(jīng)SDS-PAGE電泳及WesternBlot抗原性檢測，確認cEGFR-T7P10B融合蛋白的表達情況及其EGFR抗原性。用該重組噬菌體疫苗經(jīng)腳掌、腋下及頜下

3、皮內(nèi)和頸背部皮下多點組合免疫4w齡的C57BL/6J純系小鼠，每周1次，連續(xù)4w。免疫3w的小鼠血清與高表達EGFR的A431細胞孵育，抗鼠熒光二抗標記，流式細胞儀法檢測被標記的細胞，確認特異性鼠抗EGFR抗體的產(chǎn)生。免疫4w后，腿部外側(cè)皮下接種純系Lewis肺癌細胞株，建立C57BL/6J純系小鼠Lewis肺癌動物模型，10d后小心分離瘤體，各實驗治療組與空白噬菌體對照組瘤體均重兩兩比較采用t檢驗，觀察各實驗治療組的抗腫瘤效果。