乳桿菌噬菌體的分離、功能基因表達及抗噬菌體菌株的選育.pdf

1、乳桿菌為乳制品發(fā)酵中的重要菌株,而乳桿菌噬菌體的普遍存在給乳制品行業(yè)帶來了巨大危害。為有效地對乳桿菌噬菌體進行防治及應用,本文以德氏乳桿菌烈性噬菌體phiLdb和發(fā)酵乳桿菌溫和噬菌體φPYB5為中心展開研究,具體結(jié)果如下:
　　 1.德氏乳桿菌烈性噬菌體的分離及性質(zhì)研究
　　 德氏乳桿菌保加利亞亞種Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus(L.bulgaricus)為酸奶生產(chǎn)中

2、的重要發(fā)酵劑,在奶制品發(fā)酵過程中主要負責乳酸的快速積累,產(chǎn)品風味物質(zhì)的形成,質(zhì)地的改善等。當L.bulgaricus受噬菌體侵染時,其發(fā)酵活性將受到破壞,整個發(fā)酵過程迅速減慢或完全終止,從而嚴重影響產(chǎn)品質(zhì)量。然而,與乳球菌噬菌體相比,關(guān)于乳桿菌噬菌體的研究信息非常有限。本論文從發(fā)酵異常的酸奶樣品中分離獲得一個L.bulgaricus的烈性噬菌體,并命名為phiLdb。該噬菌體具有一個直徑大小為47.7±0.9nm的頭部和一條長129.8

3、±2nm的尾,因此被歸為Siphoviridae科。噬菌體phiLdb基因組大小約41kbp,而且不含粘性末端。該噬菌體的一步生長曲線顯示,其潛伏期和裂解期分別為45min和75min,裂解量為56±2PFU。噬菌體phiLdb對L.bulgaricus的侵染具高度專一性。二價陽離子Ca2+或Mg2+對促進宿主細胞裂解和提高噬菌斑的形成是必需的。噬菌體phiLdb在pH2-10的范圍內(nèi)均維持高的存活率,并表現(xiàn)出對乙醇和異丙醇的高耐受性。

4、然而,90℃高溫處理40min可將噬菌體phiLdb徹底滅活。Ca2+,pH及溫度對噬菌體phiLdb的吸附影響較弱。另外,噬菌體phiLdb對正常宿主細胞和經(jīng)滅活處理的細胞的吸附曲線相似,說明宿主細胞的生理狀態(tài)對該噬菌體吸附影響也不明顯。本論文對新分離到的噬菌體phiLdb的各方面性質(zhì)的研究為生產(chǎn)環(huán)境中采用最有效的噬菌體防治策略奠定了理論基礎。
　　 2.噬菌體保存方法研究
　　 噬菌體是專性活細菌細胞內(nèi)寄生的病毒,離

5、開宿主易于死亡。為長期保存噬菌體,本論文以大腸桿菌λ噬菌體和德氏乳桿菌噬菌體phiLdb為實驗材料,分別在不同穩(wěn)定劑和不同溫度下保存6個月,檢測期間噬菌體的存活性,探索最有效的保存方法。結(jié)果顯示,保存效果最好的穩(wěn)定劑為甘油,其次為二甲基亞砜,效果最差的穩(wěn)定劑為脫脂奶粉；效果最好的溫度為4℃,其次是-80℃。因此,以甘油或二甲基亞砜為穩(wěn)定劑,置于4℃,-20℃或-80℃保存均為比較簡便有效的噬菌體保存方法。
　　 3.德氏乳桿菌抗

6、噬菌體菌株的選育及性質(zhì)研究
　　 噬菌體侵染造成的巨大損失促使許多噬菌體防治策略的提出及應用。然而,噬菌體抗性菌株通常是通過DNA重組或攜帶噬菌體抗性基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移獲得的,因而賦予所得菌株潛在的安全隱患。而自發(fā)突變的方法,由于不涉及基因操作,已被認為是一種簡便有效且“天然”的獲得抗噬菌體菌株的策略。60Co-γ射線是最常用的物理誘變劑之一,并且60Co-γ射線誘變已成功用于微生物菌種的改造。本論文通過自發(fā)突變及60Co-γ射線

7、輻照誘變的方式分別獲得30株抗噬菌體的L.bulgaricus突變株。所有60株突變株均表現(xiàn)出對噬菌體phiLdb的完全抗性(EOP<10-9)。溶源性測定結(jié)果表明,除2株自發(fā)突變獲得的抗性菌株外,其他58株突變菌株的噬菌體抗性均與溶源性無關(guān)。所有抗性菌株對噬菌體phiLdb的吸附率明顯下降,說明突變菌株可干擾噬菌體的吸附。實驗證明,噬菌體phiLdb的吸附受體與肽聚糖.多糖的附屬聚合物有關(guān)。自發(fā)突變獲得的抗性菌株間的蛋白酶活性差別較顯

8、著,但是大多數(shù)抗性菌株的蛋白酶活性及pH值與初始菌株L.bulgaricus ATCC11842的類似。根據(jù)各抗性菌株的蛋白酶活性與pH值,我們以BIM10和γ19為代表,進行發(fā)酵乳試驗。兩株抗性菌株不管噬菌體phiLdb的存在與否,均表現(xiàn)出良好的發(fā)酵特性。因此,除自發(fā)突變方法外,60Co-γ射線輻照誘變也被證明是一種獲得發(fā)酵性能優(yōu)良的Lactobacillus delbrueckii抗噬菌體菌株的簡便有效方法。此外,本研究為工業(yè)生產(chǎn)中

9、提供了大量抗噬菌體德氏乳桿菌,可作為替換受噬菌體感染發(fā)酵劑的后備資源。
　　 4.可控性自裂解乳球菌的構(gòu)建
　　 在復制周期的最后一步,噬菌體將產(chǎn)生一系列酶類來裂解宿主細胞,從而釋放子代顆粒。所有雙鏈DNA噬菌體編碼的裂解相關(guān)酶類均涉及兩個蛋白,即穿孔素(holin)和裂解素(lysin),組成了“兩組分裂解盒”。對發(fā)酵乳桿菌溫和噬菌體φPYB5的基因組進行測序過程中獲得了其“兩組分裂解盒”的基因:holin(hyb5)

10、和lysin(lyb5)。為闡明噬菌體φPYB5編碼的由穿孔素(Hyb5)和裂解素(Lyb5)組成的裂解盒在乳酸菌中的作用特征,并有效利用該裂解盒構(gòu)建可控性自裂解的乳酸菌株,我們將基因hyb5-lyb5克隆到E.coli/L.lactis穿梭質(zhì)粒pSEC的nisin誘導型啟動子下游,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSEC-hyb5-lyb5。將pSEC-hyb5-lyb5電轉(zhuǎn)入Lactococcus lactis NZ9000,獲得重組菌株NZphl。

11、經(jīng)nisin誘導后,Hyb5-Lyb5的表達表現(xiàn)出高的裂解活性,使NZphl菌液的濁度(OD600)急劇下降,并釋放出大量胞內(nèi)蛋白,為利用自裂解菌株生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)乳制品奠定了基礎。
　　 5.發(fā)酵乳桿菌溫和噬菌體裂解盒在大腸桿菌中的克隆與表達
　　 與其他裂解盒不同,Hyb5經(jīng)預測只含有一個跨膜區(qū),且Lyb5具有N-端信號肽。為研究該組合奇特的裂解盒的作用特征,并闡明Lyb5作為診療劑的潛在應用,本論文中,將hyb5,lyb5

12、及hyb5-lyb5分別插入大腸桿菌表達載體,實現(xiàn)了Hyb5,Lyb5在大腸桿菌中的單獨表達和共表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示,Hyb5的分子量大小約19kDa,Lyb5大小為45kDa。Hyb5或Lyb5的單獨表達均可引起宿主菌的裂解,導致胞內(nèi)β-galactosidase的釋放。然而,Hyb5-Lyb5裂解盒的共表達則使宿主菌裂解地更迅速,更徹底。雙層平板觀測法及zymogram復性膠檢測確定了Lyb5對宿主菌的胞外裂解活性。經(jīng)zy

13、mogram復性膠分析,Lyb5展現(xiàn)出非常廣泛的裂解譜,可裂解包括致病菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)在內(nèi)的所有測試革蘭氏陽性菌及部分革蘭氏陰性菌如沙門氏菌(Salmonella typhi)等,顯示出Lyb5作為診斷工具及治療劑的巨大潛力。
　　 6.HybS-Lyb5裂解機制初步研究
　　 基于大腸桿菌噬菌體的研究結(jié)果,holin-lysin裂解盒的裂解作用模型及holin控制裂解時間的機

14、制已有報道。但對侵染其他菌的噬菌體的裂解機制研究比較缺乏。本論文試圖通過對Lyb5蛋白N-端信號肽的功能分析及對hyb5不同基因片段的表達和活性分析來闡明Hyb5-Lyb5裂解作用模型及單次跨膜Hyb5控制裂解時間的作用機制。我們將lyb5或ΔSARlyb5(除掉N端SAR序列的lyb5)插入載體pETDuet-1的多克隆位點1,將hyb5,hyb5P(hyb55’端324 bp基因片段)或hyb5N30(編碼Hyb5 N-端跨膜區(qū)30

15、個氨基酸的序列)插入載體pETDuet-1的多克隆位點2,構(gòu)建了一系列重組載體。并實現(xiàn)了各基因的單獨表達及不同基因間的共表達,觀察宿主菌的裂解情況。結(jié)果顯示,△SARlyb5與Hyb5p的共表達使宿主菌的OD值明顯下降,而△SARlyb5的單獨表達反而使宿主菌生長更旺盛,說明SAR序列可作為信號肽引導Lyb5穿膜,但Lyb5的裂解活性不依賴于SAR序列。Hyb5的N-端跨膜區(qū)單獨表達時抑制了宿主菌的生長,表明Hyb5的N-端30個氨基酸

16、可以完成跨膜功能,表現(xiàn)出對細胞的毒性。而N30hyb5與Lyb5或△SARlyb5的共表達并未引起宿主菌的大量裂解,暴露了N30hyb5輔助Lyb5或△SARlyb5穿膜功能的缺陷性。比較有趣的是,缺少C-端46個氨基酸的Hyb5對Lyb5穿膜的促進作用明顯高于Hyb5,暗示了Hyb5 C-端序列對其行使運輸活性的調(diào)節(jié)作用。至于SAR在裂解過程中是否被切割以及Hyb5作用時本身及其他調(diào)節(jié)因素的闡明,以致最后總結(jié)出Hyb5-Lyb5奇特組