禽源大腸桿菌烈性噬菌體的分離鑒定及功能基因組學(xué)分析.pdf

1、為了分離純化禽源致病性大腸埃希菌的噬菌體并測(cè)定其性質(zhì)，將近4000份鴨糞樣品來源于安徽和縣某兩個(gè)規(guī)?；唸?chǎng)及南京某市場(chǎng)某鴨場(chǎng)的鴨糞樣品離心、過濾后提取上清液，采用點(diǎn)滴法和雙層瓊脂法對(duì)致病性大腸桿菌噬菌體進(jìn)行鑒定、純化并保存，結(jié)果共分離鑒定了136株大腸埃希菌烈性噬菌體，并對(duì)其中的四十余株進(jìn)行了生物特性學(xué)分析，包括透射電鏡觀察，宿主譜測(cè)定等，對(duì)其中的HX01，NJ01進(jìn)行了基因組提取并全基因組測(cè)序。以噬菌體NJ01為例，透射電鏡下結(jié)構(gòu)判定

2、為短尾噬菌體科（Podoviridae）。宿主范圍較窄，僅能裂解被測(cè)大腸桿菌中的三株:DE172、NJ01和MC1061。效價(jià)為1.33×1013pfu/ml，將純培養(yǎng)物稀釋至108PFU/mL，每隔15min(至4h)測(cè)其一步生長(zhǎng)曲線，表明潛伏期為30min，平均裂解量為157PFU/cell，最佳感染復(fù)數(shù)為100。
　　采用自己優(yōu)化改進(jìn)過噬菌體基因組提取和純化方法，制備了高質(zhì)量的烈性噬菌體HX01和NJ01的基因組，并通過第二

3、代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了全基因組測(cè)序，以NJ01為例，測(cè)序結(jié)果顯示:NJ01全基因組大小為77，448bp，G+C含量為42.05％，共包括個(gè)136ORF以及1tRNA，并進(jìn)行了詳細(xì)注釋。NJ01屬于典型的C3分型，對(duì)NJ01根據(jù)“DNA包裝整合—頭部—尾部—尾絲蛋白—裂解相關(guān)模塊—DNA復(fù)制—轉(zhuǎn)錄”的分子模塊展開分析。對(duì)NJ01、phiEco32和KBNK135進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)了一些特殊的功能基因:如只存在于NJ01的ORF

4、52，ORF45、ORF89等均存在于三者中，但是組成、長(zhǎng)度卻完全不同等。在對(duì)與吸附特異性密切相關(guān)的尾絲蛋白研究時(shí)發(fā)現(xiàn):一個(gè)由320個(gè)氨基酸組成的保守區(qū)域的存在，此結(jié)果極有可能成為未來研究的熱點(diǎn)。比較基因組學(xué)分析顯示了NJ01與phiEco32的親緣和進(jìn)化關(guān)系非常接近，但也由于這種接近，而在宿主范圍和分離地上的巨大差別，這更能提示利用比較基因組學(xué)分析對(duì)于噬菌體功能基因的構(gòu)成研究和通過改造基因組組成來擴(kuò)大宿主譜研究的必要性。
　　為

5、了進(jìn)一步確實(shí)NJ01的結(jié)構(gòu)蛋白蛋白，對(duì)全噬菌體的制備和純化方法進(jìn)行了摸索并成功制備得到NJ01全噬菌體樣品，并將它經(jīng)二維電泳展示于二維凝膠進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，并進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)，共篩選出13個(gè)點(diǎn)（包括8種重要結(jié)構(gòu)蛋白），包括尾蛋白、棘絲蛋白，主要頭部蛋白以及DNA注射蛋白等。讓我們對(duì)于噬菌體的結(jié)構(gòu)組成和以后的比較基因組學(xué)分析有了更直觀和立體的認(rèn)識(shí)，同時(shí)豐富了基因組的注釋和解讀。
　　噬菌體用于抗菌治療和預(yù)防細(xì)菌感染已

6、有很長(zhǎng)的歷史，禽源大腸桿菌病可引起禽類的敗血癥、心包炎、腹膜炎等。為了探索已分離到的烈性噬菌體對(duì)于禽源大腸桿菌感染的療效，將南京某市場(chǎng)鴨糞樣品中分離到的烈性噬菌體，以宿主菌為DE172的烈性噬菌體NJ01為例。首先利用成熟的小鼠身上APEC感染模型，計(jì)算DE172的半數(shù)致死量。之后以2倍的半數(shù)致死量感染小鼠，實(shí)驗(yàn)組包括:感染細(xì)菌后不同時(shí)間注射等量、同濃度噬菌體，對(duì)照組設(shè)立正常小鼠腹腔中注射噬菌體的空白對(duì)照組和感染對(duì)照組，以達(dá)到綜合分析的

7、目的。測(cè)得:DE172的半數(shù)致死量為L(zhǎng)D50=1×107CFU/mL，利用分離并純化至濃度為1×1011PFU/ml的噬菌體NJ01在感染后0、3.5、4.5、5.5、6.5和7.5h取0.2ml分別進(jìn)行腹腔注射治療，治療當(dāng)天，治療組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;三天后除E、F、H組外，其余小鼠均死亡，治療組與對(duì)照組有所差異，三天后治療組與對(duì)照組之間差異數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。短期內(nèi)噬菌體在小鼠體內(nèi)會(huì)作為異物代謝掉，而在殘存小