嗜熱鏈球菌KLDS SM基因組學(xué)分析及比較基因組學(xué)分析.pdf

1、嗜熱鏈球菌是“公認(rèn)安全性（GRAS）”菌株，被廣泛應(yīng)用于一些重要發(fā)酵乳制品的工業(yè)生產(chǎn)中，是繼乳酸乳球菌之后的第二個(gè)重要的工業(yè)用乳酸菌物種，市場(chǎng)價(jià)值約400億美元。由于分子生物學(xué)研究手段的限制，傳統(tǒng)的微生物研究多集中于根據(jù)生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究菌株某些性能以及形成機(jī)制，研究范圍限于單個(gè)基因的功能，或者少數(shù)幾個(gè)基因之間的相互作用，而且需要大量的人力及物力。隨著測(cè)序技術(shù)逐漸成熟、成本的降低，微生物基因組測(cè)序變得普及使得研究人員可以從

2、生物信息的方法分析和預(yù)測(cè)生物的遺傳學(xué)特征和功能，如基因的功能、多基因之間的相互作用、生理生化代謝途徑、基因的表達(dá)調(diào)控，并設(shè)計(jì)出針對(duì)性更高的實(shí)驗(yàn)方案，節(jié)約科研成本。為了從遺傳角度上更加深入的分析與評(píng)價(jià)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的快速產(chǎn)酸、高產(chǎn)黏的嗜熱鏈球菌KLDS SM應(yīng)用于乳制品發(fā)酵的性能，同時(shí)挖掘該菌株的潛在功能，本研究對(duì)嗜熱鏈球菌KLDS SM進(jìn)行了全基因測(cè)序，繪制基因組圖譜。利用COG與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)編碼的蛋白進(jìn)行了注釋?zhuān)褂蒙镄畔⒎治?/p>

3、軟件與方法從基因組水平上詳細(xì)分析了菌株KLDS SM的環(huán)境適應(yīng)性（糖代謝、蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)、脅迫應(yīng)答、雙組份系統(tǒng)、協(xié)同作用、基因組島、假基因）、生物合成（胞外多糖、氨基酸、B族維生素）及防御系統(tǒng)（CRISPR/Cas系統(tǒng)、限制修飾系統(tǒng)、細(xì)菌素）三個(gè)方面。同時(shí)與NCBI公布的已完成全基因組測(cè)序的14株嗜熱鏈球菌進(jìn)行比較，重點(diǎn)分析了菌株KLDS SM在胞外多糖、氨基酸與B族維生素的合成及CRISPR/Cas系統(tǒng)4個(gè)方面的潛力以及其潛在特有的功

4、能。最后對(duì)菌株KLDS SM在遺傳上表現(xiàn)優(yōu)異的功能進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并且測(cè)定了該菌同保加利亞乳桿菌組合發(fā)酵與單菌發(fā)酵EPS產(chǎn)量。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴菌株KLDS SM的基本特征分析。KLDS SM基因組由一個(gè)1，856，787 bp環(huán)狀染色體組成，GC含量為39.08％。共預(yù)測(cè)到1，950個(gè)基因，其中1，732個(gè)蛋白編碼基因，129個(gè)假基因，6個(gè)rRNA操縱子，67個(gè)tRNA基因及4個(gè)ncRNA基因。分別有1，400個(gè)

5、與1，046個(gè)蛋白編碼基因注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中。⑵菌株KLDS SM的環(huán)境適應(yīng)性分析。該菌株能夠轉(zhuǎn)運(yùn)且利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖與β-葡萄糖苷，經(jīng)糖酵解途徑生成L-乳酸，但不具有完整的檸檬酸途徑及磷酸戊糖途徑;有完整的蛋白水解系統(tǒng);可編碼多個(gè)與脅迫相關(guān)的蛋白，且多與酸、氧與熱脅迫有關(guān);有4組完整且具有功能的TCS，參與調(diào)解自身細(xì)菌素的合成及生物膜的形成等過(guò)程;預(yù)測(cè)出9個(gè)基因組島多與生物合成、代謝、防御、轉(zhuǎn)運(yùn)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

6、相關(guān);蛋白編碼基因中假基因占6.9％，與糖類(lèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及氨基酸的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)等方面有關(guān)。⑶菌株KLDS SM的生物合成分析。該菌具有一個(gè)同高產(chǎn)胞外多糖的菌株ASCC1275高度一致(99％ identity)的胞外多糖基因簇，初步測(cè)定胞外多糖的產(chǎn)量約331 mg/L;其可合成His、Trp、Ser、Cys、Gly、 Val、Leu與Ala8種氨基酸，其中Val、Leu、Trp為人體必需氨基酸，且15株菌的氨基酸合成能力相對(duì)保守;可從頭合

7、成葉酸，但無(wú)法合成其他B族維生素，15株菌的B族維生素生物合成能力差異不大。⑷菌株KLDS SM的防御系統(tǒng)。該菌有4個(gè)CRISPR/Cas系統(tǒng)，預(yù)測(cè)CRISPR位點(diǎn)的活性由強(qiáng)到弱為CRISPR1＞CRISPR4＞CRISPR3＞CRISPR2，而位點(diǎn)2的CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)生了退化;R-M系統(tǒng)并不豐富，僅有2個(gè)完整的Ⅰ型R-M系統(tǒng);基因組中存在2個(gè)細(xì)菌素合成的基因簇，但合成羊毛硫抗生素的基因簇發(fā)生了退化。⑸與15株嗜熱鏈球菌的比較

8、基因組分析。基因組之間具有非常保守的同線性，泛基因組由4，094個(gè)基因組成且呈開(kāi)放型，核心基因組由1，240個(gè)基因組成。菌株KLDS SM與菌株MN-BM-A02、菌株ASCC1275、菌株ND07三者的親緣關(guān)系最近，與菌株LMG18311、菌株CNRZ1066親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。⑹單菌、組合發(fā)酵EPS產(chǎn)量的比較結(jié)果表明，組合發(fā)酵均較單菌發(fā)酵產(chǎn)EPS多。在發(fā)酵4-8 h時(shí)，KLDS SM與KLDS08007組合發(fā)酵產(chǎn)生EPS的速率最快，速率約