2型豬鏈球菌無(wú)毒株的分離鑒定與比較基因組學(xué)研究.pdf

1、2型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype2，SS2)不僅可以感染仔豬，也可以感染人類，是危害養(yǎng)豬業(yè)及其從業(yè)相關(guān)人員的重要的人畜共患病病原體。豬鏈球菌病已經(jīng)出現(xiàn)40多年了，但是到目前為止仍不斷有新的感染病例出現(xiàn)，且在東南亞等國(guó)，該疾病的流行趨勢(shì)沒(méi)有減弱。中國(guó)曾經(jīng)爆發(fā)了兩次大規(guī)模的人感染豬鏈球菌的群體公共衛(wèi)生事件，且多數(shù)患者因細(xì)菌感染而引發(fā)了中毒性休克綜合征(streptococcal toxic shocksy

2、ndrome，STSS)，從而無(wú)法扭轉(zhuǎn)病程，最終62.7％～81.3％的患者死亡。本課題組密切關(guān)注這兩次突發(fā)感染事件，從中分離到了導(dǎo)致這兩次疾病流行的高致病性2型豬鏈球菌，S.suis98HAH12和s.suis05ZYH33，并對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的生物學(xué)特性研究和基因組學(xué)特性分析。其中，我們確定高致病性2型豬鏈球菌所特有的一個(gè)大小約為89 kb的致病島(89K pathogenicity island,89K PAI)，是導(dǎo)致這兩次疾病流

3、行致死率較高的主要原因，且89K PAI上含有毒力因子(virulence-associated factor, VAF)、二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction system，TCSTS)和四型分泌系統(tǒng)(typeⅣsecretion system，T4SS)等與細(xì)菌致病性密切相關(guān)的基因元件。
　　已鑒定出的豬鏈球菌的毒力因子有20多個(gè)，其中最主要的是莢膜多糖(capsularpoly

4、saccharides，CPS)和豬鏈球菌溶血素(suilysin，SLY)，CPS不僅可以為細(xì)菌提供保護(hù)屏障，還參與細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的抗吞噬能力;SLY可以增加細(xì)菌密度，促進(jìn)細(xì)菌引發(fā)宿主炎癥反應(yīng)。其他毒力因子也參與到細(xì)菌與宿主的相互作用和促進(jìn)細(xì)菌透過(guò)宿主的血腦屏障等。
　　但是，豬鏈球菌毒力的來(lái)源及分化尚不清楚，尋找有效的預(yù)防手段是防治豬鏈球菌病的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)。因此本課題以從流行區(qū)豬群中分離到的一株不致病的2型豬鏈球菌為研究基礎(chǔ)，通過(guò)

5、對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定、全基因組測(cè)序和比較基因組學(xué)分析，探討豬鏈球菌各菌株之間毒力演化和基因組重排的方式，探索可以預(yù)防該疾病的疫苗。
　　主要研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.2型豬鏈球菌05HAS68生物學(xué)特性的鑒定:分別對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)觀察和革蘭染色，用分光光度計(jì)法測(cè)定細(xì)菌的溶血活性，列舉活菌數(shù)目測(cè)定細(xì)菌的全血存活能力。用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)菌對(duì)Hep-2細(xì)胞的粘附能力，用梅里埃生化檢測(cè)卡鑒定細(xì)菌的生化反應(yīng)類型。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)我

6、們確定S.suis05HAS68與高致病性菌株S.suis05ZYH33相比，是一株具有較高粘附能力但溶血活性較差的血清2型豬鏈球菌。進(jìn)一步利用16SrRNA基因分型和多位點(diǎn)序列分型，證明該菌株屬于豬鏈球菌屬，ST28型。
　　2.2型豬鏈球菌05HAS68全基因組測(cè)序及全基因組注釋:利用二代測(cè)序技術(shù)Iontorrent PGM測(cè)序儀，分別構(gòu)建待測(cè)基因組的測(cè)序文庫(kù)，其中Mate-pair4kb庫(kù)和shotgun小片段隨機(jī)庫(kù)分別達(dá)到

7、127×和114×的測(cè)序覆蓋度。采用Newbler v2.8和CLC GenomicsWorkbench對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行拼接后得到S.suis05HAS68的全基因組序列長(zhǎng)度為2，176，073 bp。通過(guò)RAST在線注釋和比對(duì)BLAST、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)S.suis05HAS68進(jìn)行全基因組注釋。利用DNAStar軟件包、CGView Server、tRNAScan-SE1.21和RNAmmer1.2，分析S.suis05

8、HAS68基因組的一般特性。注釋及分析結(jié)果顯示，S.suis05HAS68基因組的GC含量為41.2％，共編碼2009個(gè)基因，另外還編碼56個(gè)tRNA基因和12個(gè)rRNA基因。
　　3.2型豬鏈球菌05HAS68與有毒株的比較基因組學(xué)分析:采用比對(duì)毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)和BLASTp比對(duì)的方法，鑒定S.suis05HAS68基因組上存在的VAF和TCSTS。通過(guò)IslandViewer、CRISPRfinder和ProphageFinde

9、r鑒定S.suis05HAS68基因組上可能的基因組島、CRISPR結(jié)構(gòu)和前噬菌體結(jié)構(gòu)。利用ACT和Mauve軟件分析S.suis05HAS68與其他豬鏈球菌基因組大規(guī)模重排的方式和規(guī)律。我們發(fā)現(xiàn)S.suis05HAS68與S.suis05ZYH33和S.suis98HAH12共有1751個(gè)基因，但是S.suis05HAS68特有253個(gè)基因。其中包括1個(gè)CRISPR結(jié)構(gòu)、4個(gè)前噬菌體結(jié)構(gòu)和1個(gè)113K代謝島（半乳糖代謝途徑和巖藻糖代謝

10、途徑）。S.suis05HAS68基因組中缺少重要的VAF，例如SLY、MRP、EPF和毒力相關(guān)蛋白E等，SalK/SalR、NisK/NisR、VirR/VirS和RevS等毒力相關(guān)的TCSTS在S.suis05HAS68基因組中也是缺失的。S.suis05HAS68基因組與其他豬鏈球菌基因組之間存在由轉(zhuǎn)座酶和前噬菌體介導(dǎo)的大規(guī)模基因組重排，且重排圍繞基因組的復(fù)制軸(ori/ter axis)呈“X形”。
　　4.89K PAI

11、在S.suis各菌株中的分布情況及S.suis的系統(tǒng)發(fā)生分析:比對(duì)89K PAI序列在豬鏈球菌以及其他鏈球菌中的分布情況。在豬鏈球菌P1/7、A7、GZ1、S735、ST1和ST3菌株中沒(méi)有比對(duì)到89K PAI的同源序列，在豬鏈球菌SC84和BM407中比對(duì)到了絕大部分的89K PAI同源序列，其他豬鏈球菌中則比對(duì)到了一部分89K PAI同源片段，另外在無(wú)乳鏈球菌和肺炎鏈球菌中也比對(duì)到了部分89K PAI的同源序列。綜合評(píng)價(jià)用rpoB、

12、16S rRNA、ITS(internal transcribed spacer)和core gene構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，可以看出S.suis05HAS68在進(jìn)化關(guān)系上與高致病性2型豬鏈球菌相距較遠(yuǎn)。
　　5.2型豬鏈球菌05HAS68的毒力鑒定及免疫保護(hù)初探討:用同等劑量(1×108 CFU)的S.suis05HAS68、高致病性菌株05ZYH33和98HAH12分別攻擊仔豬。攻毒實(shí)驗(yàn)證明，&.suis05HAS68對(duì)動(dòng)物不具有致

13、死性。分別用無(wú)毒株05HAS68和基因敲除改造的無(wú)毒株△salKR免疫仔豬2次后，再用高致病性菌株05ZYH33或98HAH12進(jìn)行攻擊，觀察無(wú)毒株05HAS68對(duì)仔豬是否具有免疫保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，事先用無(wú)毒株05HAS68免疫的動(dòng)物可免受高致病性菌株的攻擊，但是用基因敲除改造的無(wú)毒株△salKR免疫的仔豬，不能抵抗高致病性菌株05ZYH33的攻擊，初步說(shuō)明S.suis05HAS68對(duì)仔豬具有免疫保護(hù)效果。
　　綜上所述，本