小尾寒羊5個與繁殖和疾病抗性相關基因的克隆及比較基因組學分析.pdf

1、綿羊作為世界上重要的可再生資源,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位.在雞、牛和豬已經(jīng)完成初步的基因組測序的情況下,綿羊基因組的研究現(xiàn)狀呈現(xiàn)明顯的滯后狀態(tài).基于比較基因組學的研究手段,在基因組圖譜和測序的基礎上,利用模式生物基因組研究中獲得的信息推測畜禽品種中的基因數(shù)目、位置、功能、表達機理和物種進化,可以實現(xiàn)對畜禽品種重要經(jīng)濟性狀候選基因的鑒定、克隆和特性的認識.本課題嘗試在中國地方綿羊品種的功能基因組研究中引入比較基因組的研究方法,進行綿羊繁

2、殖和疾病抗性相關基因的克隆,為中國地方綿羊的選育和品種資源保護提供理論依據(jù),并用以指導綿羊品種的分子育種和品種資源的保護工作. 本實驗共克隆了綿羊YB-1、綿羊和山羊ISGl5、TLR9、MSY2和CIBl5個基因,并對各個基因進行了比較基因組學分析,結果如下: 綿羊YB-1 mRNA全長1449bp(GenBankNo.EF488163),ORF為867核苷酸,可編碼288個氨基酸,該蛋白具有典型的CSD結構域,氨基酸序列與人

3、、犬、小鼠、大鼠、黑猩猩、恒河猴等的一致性均在95﹪以上.綿羊YB-1,為無TATA盒的啟動子,5'-UTR分布有GATA-1、GATA-2、GATA-3和AML-1a轉(zhuǎn)錄因子的結合位點.多物種的YB-1 5'-UTR.的轉(zhuǎn)錄因子結合位點分析表明,YB-1基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控的復雜性與物種進化復雜程度可能存在一定的相關性.43個物種YB-1及其直向同源物蛋白的聚類與生物進化的方向基本一致,并且蛋白的3-D結構也同樣保守,但各物種YB-1的非

4、翻譯區(qū)在基因調(diào)控及表達中發(fā)揮了不同作用,從而在進化方向上存在一定差異. 建立了高效的綿羊YB-1原核表達體系,為進一步獲得抗血清并應用到YB-1蛋白功能研究奠定了基礎. 小尾寒羊睪丸和卵巢中共克隆了75個非冗余的YB-1選擇性剪接產(chǎn)物克隆,其中卵巢組織中26個,睪丸組織中49個,涵蓋了5'端或3'端的選擇性剪接、外顯子跳躍及內(nèi)含子保留等3種主要的剪接方式.其中34條編碼的氨基酸殘基超過20個,根據(jù)編碼產(chǎn)物blastp分析

5、的結果可將其分為6組.第一組共10個選擇性剪接產(chǎn)物(卵巢中1個,睪丸中9個),編碼蛋白均為YB-1長度不等的C端結構域.第二組共計17個(卵巢中4個,睪丸中13個)與犬中存在的另一種YB-1選擇性剪接的蛋白序列一致性達到94﹪.第三組共3條序列,第四組共2條序列,均為睪丸中的選擇性剪接產(chǎn)物,功能未知.第五組序列為1條,12個AA與多物種YB,1的C段結構域存在85﹪的一致性.第六組序列為卵巢中的1條選擇性剪接方式,功能未知.綿羊YB-1

6、基因在不同生殖系統(tǒng)中可能存在大量的非編碼mRNA,睪丸非編碼mRNA為42﹪(21/49),卵巢的非編碼mRNA為84﹪(22/26).7條150bp以下的YB-1擴增產(chǎn)物的RNA二級結構預測呈現(xiàn)一種類似的"莖泡"樣結構,并隨著序列堿基數(shù)目增加在主莖環(huán)結構外也增加了其他莖環(huán)結構,使整體的二級結構呈現(xiàn)"十字"型變化. 小尾寒羊和濟寧青山羊ISG15 DNA全長分別為1033bp和911bp,均由兩個外顯子構成.綿羊ISG15mRN

7、A序列與其他物種的相似性分別為,牛94﹪、黑猩猩77﹪、人77﹪、恒河猴77﹪、小鼠77﹪.蛋白的相似性分別為牛87﹪、黑猩猩66﹪、人66﹪、恒河猴67﹪、小鼠63﹪.多物種的ISGl5蛋白均存在2個泛素同源結構域,并且其3-D結構也顯示出較高的相似性.已克隆的小尾寒羊序列在904bp出現(xiàn)1個G的插入突變,13bp后又出現(xiàn)了1個G的缺失突變,由此造成小尾寒羊ORF框ORF從GellBaIlk綿羊ISGl5mRNA參照序列(NM-001

8、009735.1)的474bp延長至55525bp,編碼氨基酸殘基的個數(shù)也從GenBank的參照序YlJNP 001009735.1的157個氨基酸殘基變?yōu)?74個氨基酸殘基,3'-UTR也相應地縮短為19bp.濟寧青山羊的ISGl5 ORF為402bp,編碼133個氨基酸殘基.ISGl5的啟動子區(qū)分析顯示該基因為無TATA盒啟動子,除犬DPE出現(xiàn)于mRNA的+4l～+45bp外,多物種ISGl5的DPE均以(GTGA)AGATG的形式

9、出現(xiàn)于+23～+27.小尾寒羊和濟寧青山羊的DNA預測出的蛋白由于DNA序列中存在的堿基插入或(和)缺失的現(xiàn)象,使其ISGl5蛋白C末端結構并不存在Lcu-Arg-Lcu-Arg-Gly.Gly(LRLRGG)序列. 綿羊基因組中TLR9以單拷貝形式出現(xiàn),基因克隆產(chǎn)物長4192 bp,包括115 bp的5,-UTR、2個Exon和44bp的3'-UTR.小尾寒羊TLR9經(jīng)基因預測后,與其他哺乳動物TLR9mRNA的相似性分別為,

10、牛96﹪,豬87﹪,馬86﹪,貓85﹪,犬85﹪,人83﹪,黑猩猩83﹪,恒河猴83﹪,大鼠78﹪,小鼠77﹪,和負鼠70﹪.TLR9蛋白與其他各物種的相似性分別為,牛95﹪,豬85﹪,馬83﹪,貓84﹪,犬83﹪,人79﹪,黑猩猩79﹪,恒河猴79﹪,大鼠72﹪,小鼠73﹪,和負鼠60﹪.多物~TLR9蛋白功能域在數(shù)量、種類及相對位置上均有不同,因而造成恒河猴和小鼠在多物種TLR9蛋白功能域聚類分析與基因的系統(tǒng)進化樹的聚類的位置上存在

11、差異. 綿羊基因組中MSY2以單拷貝形式出現(xiàn),基因克隆產(chǎn)物長:4927 bp,包括外顯子2～8和493 bp的3'-UTR,在綿羊的精子和卵子發(fā)生過程中,MSY2可能在基因轉(zhuǎn)錄、RNA穩(wěn)定性和RNA的翻譯調(diào)控中發(fā)揮重要作用. CIBl基因組擴增產(chǎn)物為3Kb,包括7個外顯子及50bp的5'-UTR和189bp的3'-UTR.CIBl睪丸cDNA擴增產(chǎn)物799 bp,ORF為576bp,編碼191個氨基酸.多物種CIBl非常