核心蛋白聚糖對肺腺癌細胞生長侵襲的影響及其靶向治療的實驗研究.pdf

1、背景:腫瘤演變的最終歸宿取決于腫瘤與微環(huán)境的相互作用，兩者的互動關(guān)系成為近年腫瘤研究的熱點與難點。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移可以看作是對這種動態(tài)平衡的破壞。細胞的微環(huán)境主要包括細胞外基質(zhì)，直接接觸的相鄰細胞，生長因子、激素等可溶性介質(zhì)及間質(zhì)組織。 核心蛋白聚糖(Decorin)是細胞外基質(zhì)的重要組成成分，是一種在體內(nèi)組織分布廣泛，可以和多種生長因子及細胞因子結(jié)合，參與細胞生長調(diào)節(jié)及組織重塑過程的小分子蛋白聚糖。近年來在國際上廣

2、泛受注目。許多研究結(jié)果表明Decorin是一種抗增殖因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、生長密切相關(guān)，極可能是一種腫瘤抑制物，這就提示Decorin有可能成為新的抗腫瘤藥物。 Decorin由一個球形的核心蛋白和一條含CS/DS的糖胺聚糖(GAG)組成。其分子量為92-5kDa，核心蛋白為40kDa，屬于小分子間質(zhì)性PG家族成員，又稱為PG Ⅱ，PG40，因最早發(fā)現(xiàn)其具有修飾膠原作用又稱為飾膠蛋白。 為進一步了解decorin與腫

3、瘤的關(guān)系，國內(nèi)外學者通過直接干預、原位雜交和基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)對于肝癌、結(jié)腸癌、齒齦癌、卵巢癌、腎癌及胃癌等方面進行了研究。表明Decorin對多種腫瘤細胞有抑制作用，其機制可能是:1)decorin可與轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)結(jié)合，抑制TGF-β的生物活性；2)decorin使p 21表達增加，抑制腫瘤細胞生長。目前已明確TGF-β和p21對肺癌有作用，但缺少decorin對肺癌細胞生長影響的研究報道，因此本課題以人肺腺癌細胞株A5

4、49及裸鼠移植瘤模型為研究對象，進行了三個部分研究：第一部分decorin對人肺腺癌細胞株A549體外生長的影響；第二部分decorin對人肺腺癌細胞粘附、遷延及侵襲能力的影響；第三部分decorin靶向治療裸鼠人肺腺癌A549移植瘤的實驗研究。了解decorin對肺腺癌細胞體外生長及侵襲力的影響，并探討其可能機制，進一步觀察decorin對裸鼠移植瘤生長的抑制作用。旨在為探討decorin在肺腺癌形成機制中的作用提供理論依據(jù)，為肺腺癌

5、的治療提供新的思路。 方法: 1.細胞培養(yǎng)人肺腺癌細胞株A549培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。 2.MTT法檢測decorin對人肺腺癌細胞A549生長的影響對數(shù)生長期細胞加入decorin，使最終濃度為0、2.5、5、10、20、30、40μg/ml，實驗分為7組，每組設(shè)3個復孔。7組細胞分別培養(yǎng)0 h，24h，48h，72h，96h，120h后行MTT實驗。酶標儀上測定波長為49

6、0nm，計算A549細胞的存活率。 3.流式細胞術(shù)檢測細胞增殖和凋亡比率收集對數(shù)期細胞與濃度為0、5、10、20、30、40μg/ml的decorin共同孵育0-96h，收集細胞于離心管內(nèi)，離心，洗滌，固定，染色，置流式細胞儀上，每份標本測定20000個細胞，測量速率為150～200個細胞/s。用MultiCycle for Windows軟件分析被采集資料，計算細胞凋亡比率。 4.RT-PCR法檢測decorin對其m

7、RNA的表達的影響收集對數(shù)期細胞與濃度為0、10、20、30、40、50μg/ml的decorin共同孵育24h，按照decorin的濃度分為5組，進行RNA提取，定量后以其為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，然后用引物進行PCR擴增，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，decorin mRNA的表達量通過與內(nèi)對照光密度的比較來判斷。 5.Elisa法檢測TGF-β蛋白的表達收集對數(shù)期細胞，加decorin，使最終濃度為對照組0μg/ml、實

8、驗組30μg/ml，每個組設(shè)定3復孔，培養(yǎng)4d，激活標本，建立標準曲線，檢測。 6.Western blot法檢測p21蛋白的表達收集對數(shù)期細胞，加decorin，使最終濃度為對照組0μg/ml、實驗組30μg/ml，細胞提取細胞中總蛋白，測定出樣品的蛋白質(zhì)含量，然后將蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色，轉(zhuǎn)膜觀察結(jié)果。 7.decorin對A549細胞體外粘附、侵襲及遷移的影響檢測收集對數(shù)期細胞，加decorin，使最終濃

9、度為對照組0μg/ml、實驗組2.5μg/ml。包被及水化基底膜，接種及培養(yǎng)細胞，然后MTT比色法檢測，計算細胞粘附率。Transwell小室鋪Matrigel膠，培養(yǎng)細胞，趨化，固定，染色，顯微鏡下計數(shù)，計算侵襲率。包被及水化基底膜，制備培養(yǎng)單層細胞，用人工劃痕法，在相差顯微鏡下隨機選擇5個100×視野內(nèi)計算遷移到劃痕空隙中的細胞總數(shù)。 8.構(gòu)建移植瘤裸鼠模型檢測decorin體內(nèi)靶向作用構(gòu)建移植瘤裸鼠模型后，decorin直

10、接移植瘤內(nèi)注射，觀察其抗移植瘤生長效應，包括一般狀況，局部實體瘤生長抑制率的測定以及病理組織學檢測。取腫瘤組織，Western法檢測P21蛋白的表達，ElISA法檢測TGF-β蛋白的表達。 結(jié)論: 1.Decorin能夠抑制A549腫瘤細胞的體外增殖，且這種增殖抑制作用呈劑量和時間依賴性。 2.Decorin抑制肺癌細胞生長，其機制可能與上調(diào)p21，抑制TGF-β表達，阻滯肺癌細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換，促進肺癌細胞