miR-519d靶向eIF4H對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲的抑制作用.pdf

1、背景和目的：
　　本課題主要研究肺腺癌組織和細(xì)胞中miR-519d和eIF4H的表達(dá)情況，分析miR-519d和eIF4H異常表達(dá)對(duì)肺腺癌的生物學(xué)行為的影響，探索miR-519d發(fā)揮作用的可能性機(jī)制。本課題分六個(gè)章節(jié)進(jìn)行闡述。
　　第一章 肺腺癌組織中miR-519d和eIF4H的表達(dá)分析
　　方法：
　　1.收集標(biāo)本，69例肺腺癌組織與配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本均來自于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，符合倫理委員會(huì)審查標(biāo)準(zhǔn)。

2、
　　2.運(yùn)用實(shí)時(shí)qRT-PCR的方法檢測(cè)69例肺腺癌組織與配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本中miR-519d和eIF4H的表達(dá)情況。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用Pearson相關(guān)分析miR-519d和eIF4H之間的相關(guān)性以及二者的表達(dá)與肺腺癌患者年齡，性別，臨床病理類型，腫瘤TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.與69例患者癌旁正常組織相比，與之對(duì)應(yīng)的肺腺癌組織中miR-519d的表達(dá)呈現(xiàn)顯著下調(diào)

3、(P＜0.05)，eIF4H的表達(dá)呈現(xiàn)顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　2.肺腺癌組織中，miR-519d和eIF4H的表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，R2=0.563，r=-0.75，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.miR-519d與eIF4H的表達(dá)與肺腺癌患者的性別，年齡，疾病分化程度，TNM分期無關(guān)(P＞0.05)，與肺腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P＜0.05)。
　　第二章 上調(diào)miR-519d的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)

4、胞增殖的影響
　　方法：
　　1.培養(yǎng)A549和H1299肺癌細(xì)胞。
　　2.通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-519d agomir(miR-519d激動(dòng)劑)獲得miR-519d表達(dá)上調(diào)的A549和H1299肺腺癌細(xì)胞作為miR-519d agomir實(shí)驗(yàn)組;將miR-519dscramble轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為miR-519d scramble陰性對(duì)照組;將未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照組。
　　3.運(yùn)用實(shí)時(shí)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR

5、-519d表達(dá)上調(diào)的肺腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組，miR-519d scramble陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞中miR-519d和eIF4H的表達(dá)情況。
　　4.運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組中表達(dá)上調(diào)的miR-519d對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS21.0分析各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，兩樣本定量資料應(yīng)用“t檢驗(yàn)”，配對(duì)樣本資料應(yīng)用“配對(duì)樣本t檢驗(yàn)”，多樣本定量資料應(yīng)用“單因素方差分析”，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.

6、05。
　　結(jié)果：
　　1.A549和H1299肺癌細(xì)胞系細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-519d agomir后，miR-519d agomir組細(xì)胞中miR-519d的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的上調(diào)(P＜0.05)。
　　2.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-519d scramble陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比， miR-519d agomir組細(xì)胞增殖數(shù)目明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有差異(P＜0.05)。
　　3.肺癌細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

7、，與miR-519d scramble陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，miR-519d agomir組細(xì)胞克隆形成數(shù)目顯著降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有差異(P＜0.05)。
　　第三章 miR-519d表達(dá)上調(diào)對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響
　　方法：
　　1.將第二章中經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞，各細(xì)胞系均分為以下三組，miR-519d agomir實(shí)驗(yàn)組，miR-519d scramble陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組
　　2.運(yùn)用細(xì)胞侵襲Tran

8、swell實(shí)驗(yàn)比較各組穿膜細(xì)胞數(shù)，研究體外上調(diào)miR-519d的表達(dá)對(duì)各組細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS21.0分析各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，多樣本定量資料應(yīng)用“單因素方差分析”，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.Transwell結(jié)果顯示，與miR-519d scramble陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，miR-519d agomir組穿膜細(xì)胞的數(shù)目顯著降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有差異(P＜0.05)

9、。
　　第四章 上調(diào)miR-519d的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　方法：
　　1.購買并飼養(yǎng)30只BALB/C雌性裸鼠
　　2.根據(jù)皮下注射的A549和H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的不同，將裸鼠分為6組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組5只，分別為轉(zhuǎn)染miR-519d agomir的A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染miR-519d scramble的A549細(xì)胞陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組;轉(zhuǎn)染miR-519d agomir的H12

10、99細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染miR-519d scramble的H1299細(xì)胞陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組。
　　3.應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組miR-519d的表達(dá)水平
　　4.應(yīng)用小動(dòng)物活體成像技術(shù)，每隔一周進(jìn)行觀察，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷裸鼠體內(nèi)的瘤體生長(zhǎng)情況
　　5.裸鼠培養(yǎng)至第四周，解剖取出皮下移植瘤，經(jīng)石蠟包埋切片后，進(jìn)行Ki67染色，通過鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的增殖情況。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件S

11、PSS21.0分析各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，兩樣本定量資料應(yīng)用“t檢驗(yàn)”，多樣本定量資料應(yīng)用“單因素方差分析”，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.在A549和H1299肺癌細(xì)胞中，miR-519dagomir轉(zhuǎn)染組miR-519d的表達(dá)均明顯上調(diào)，與miR-519d scramble和空白對(duì)照組相比具有顯著差異(P＜0.05)。
　　2.小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示，在miR-519d表達(dá)上調(diào)的情況下，A549和H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)

12、染成瘤后表現(xiàn)出的熒光信號(hào)明顯弱于miR-519d scramble組和空白對(duì)照組，這種強(qiáng)弱之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.裸鼠移植瘤石蠟切片Ki67實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在miR-519d表達(dá)上調(diào)的情況下，移植瘤細(xì)胞中Ki67陽性細(xì)胞明顯低于miR-519d scramble組和空白對(duì)照組，這種數(shù)目多少之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第五章 miR-519d在肺腺癌中發(fā)揮生物學(xué)作用機(jī)制的初步探索

13、r>　　方法：
　　1.應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-519d和eIF4H的3'UTR區(qū)是否存在互補(bǔ)結(jié)合部位。
　　2.構(gòu)建野生型和突變型eIF4H3'UTR的重組雙熒光素酶報(bào)告載體。
　　3.運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-519d是否可靶向作用于eIF4H。
　　結(jié)果：
　　1.miR-519d與eIF4H mRNA的3'UTR區(qū)存在互補(bǔ)結(jié)合。
　　2成功構(gòu)建了野生型Wt-pmirGLO-eIF

14、4H和突變型Mt-pmirGLO-eIF4H雙熒光素酶報(bào)告載體
　　3.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-519d agomir轉(zhuǎn)染組中，在miR-519d表達(dá)水平上調(diào)的情況下，eIF4H蛋白的表達(dá)呈明顯下調(diào)(P＜0.05)。
　　4.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)肺腺癌細(xì)胞中miR-519d可靶向調(diào)控eIF4H的表達(dá)。
　　第六章 上調(diào)miR-519d與下調(diào)eIF4H對(duì)肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)作用效果的比較
　　方

15、法：
　　1.合成si-eIF4H，沉默細(xì)胞中eIF4H的表達(dá)。
　　2.通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-519dagomir(miR-519d激動(dòng)劑)獲得miR-519d表達(dá)上調(diào)的肺腺癌細(xì)胞A549和H1299;通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-eIF4H獲得eIF4H表達(dá)下調(diào)的肺腺癌細(xì)胞A549和H1299。根據(jù)細(xì)胞處理方式的不同，將各肺癌細(xì)胞分別分為4組，miR-519d agomir組，si-eIF4H組，miR-519d scramble，空

16、白對(duì)照組。
　　3.通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中eIF4H蛋白的表達(dá)情況
　　結(jié)果：
　　1.與miR-519d scramble組和空白對(duì)照組相比，miR-519dagomir組和si-eIF4H組細(xì)胞中eIF4H蛋白的表達(dá)水平均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析二者的表達(dá)情況無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與miR-519

17、d scramble組和空白對(duì)照組相比，miR-519d agomir轉(zhuǎn)染組和si-eIF4H細(xì)胞轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞增殖明顯受到抑制，且二者受抑制的程度無明顯差異（P＞0.05）。
　　3.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與miR-519d scramble組和空白對(duì)照組相比，miR-519d agomir轉(zhuǎn)染組和si-eIF4H細(xì)胞轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞侵襲明顯受到抑制，且二者受抑制的程度無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：