飾膠蛋白聚糖對大鼠系膜細胞生長的影響及其泛素化調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、前言：
　　飾膠蛋白聚糖(decorin,DCN)是一種可由腎小球系膜細胞(mesangial cell,MC)分泌、富含亮氨酸的蛋白聚糖,在調(diào)控細胞生長及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成、組成等方面都發(fā)揮重要的作用。DCN的過表達可抑制體外培養(yǎng)MC的生長及其TGF-β1蛋白的合成,并可影響其TIMP-2mRNA的表達和Ⅳ型膠原的合成,因此,DCN是一個很有前景的防治腎小球。腎炎及阻止腎小球硬化的

2、細胞因子。近年來研究進一步發(fā)現(xiàn),DCN還可抑制多種腫瘤細胞的生長,并有促進腫瘤細胞凋亡的作用,其機制可能與EGFR蛋白表達的下調(diào)及p21蛋白表達的上調(diào)相關。但DCN的這一作用,在非腫瘤細胞中的報道不盡相同,盡管近年有研究發(fā)現(xiàn)DCN能夠上調(diào)P21的表達,但其對非腫瘤細胞是否具有抑生長、促凋亡作用,以及是否與EGFR表達下調(diào)有關等問題仍存在分歧。本課題組在前期實驗中,已證實過表達DCN可抑制體外培養(yǎng)MC的生長,但有關DCN能否促進MC凋亡以

3、及其抑制MC生長是否通過EGFR表達改變,目前尚不清楚。
　　由于DCN具有重要的生物學效應,尤其在拮抗腎小球腎炎MC增生和ECM合成過程中起重要作用,故在實驗中如何增加DCN的穩(wěn)定性,并增強其生物活性,被視為對DCN進行深入研究的重點。近年來,一些學者在對DCN蛋白活性調(diào)節(jié)的研究中,發(fā)現(xiàn)DCN的降解代謝可能經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)介導,有學者在對卵巢腫瘤的研究中,應

4、用蛋白酶體抑制劑MG132處理后,發(fā)現(xiàn)該腫瘤細胞的DCN蛋白總量升高,提示DCN的降解可能是通過泛素化調(diào)節(jié)的。UPP是一個參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解過程,并影響細胞生理功能的重要系統(tǒng),已有許多研究表明,其對很多種細胞的生理活動起重要調(diào)節(jié)作用。但至今,仍沒有直接證據(jù)表明DCN在細胞內(nèi)是通過UPP而發(fā)生降解及其影響因素。因此,明確MC內(nèi)DCN降解與UPP的關系,并探索通過調(diào)控該途徑可否達到增強或減弱DCN蛋白的活性、繼而影響腎MC活動的目的,是本

5、課題研究的一個重要出發(fā)點。
　　有研究表明,UPP是一個可逆的過程,即細胞內(nèi)還同時存在一些特異性的去泛素化蛋白酶,后者能阻礙靶蛋白的降解而對其形成負反饋調(diào)節(jié)。泛素特異性修飾酶2-69(ubiquitin-specific processing protease 2-69,USP2-69)為泛素特異性修飾酶家族(iubiquitin-specific processing proteases,USPs)中的一個重要成員,不僅已被證實

6、在腎組織內(nèi)呈現(xiàn)高表達,而且還是一個與細胞增殖和凋亡相關的去泛素化酶。本課題組前期實驗證實,USP2-69表達上調(diào)與腎小球腎炎病變中MC增生有一定的相關性,而DCN對MC的生長有抑制作用,因此,我們設想USP2-69有可能是一種與DCN表達密切相關的去泛素化酶,可能依賴其對蛋白降解水平的調(diào)節(jié)而影響DCN的穩(wěn)定性及活性。
　　因此,本課題采用基因轉(zhuǎn)染、RNA干擾和免疫共沉淀等技術,觀察:DCN對MC生長和凋亡的影響及其相關機制;明確M

7、C內(nèi)DCN的降解途徑及其影響因素,以及調(diào)控該途徑對DCN功能的影響;觀察MC內(nèi)USP2-69和DCN的結(jié)合及定位,以及USP2-69對DCN的泛素化和細胞內(nèi)DCN蛋白水平的影響,以期為治療以系膜增生為特征的腎小球疾病尋找新的作用靶點而提供實驗依據(jù)。
　　第一部分DCN對大鼠腎MC生長及凋亡的影響
　　目的：探討DCN對大鼠腎MC生長及凋亡的影響及其可能機制。
　　方法：純化pcDNA3.1A-DCN真核表達質(zhì)粒及酶切鑒

8、定;將pcDNA3.1A-DCN質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MC,并用DCNsiRNA雙鏈寡核糖核苷酸對其進行干擾。再分別采用RT-PCR和Western blot方法,檢測DCN的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達;應用流式細胞儀和Hoechst 33258染色法分別檢測細胞周期和凋亡;用Western blot方法,分別檢測活性caspase-3、EGFR、p21和TGF-β1的蛋白表達。
　　結(jié)果：純化的pcDNA3.1A-DCN質(zhì)粒經(jīng)過EcoRI及Xba

9、I雙酶切后得到約5400bp大小的pcDNA3.1A條帶和1068bp大小的DCN目的基因條帶。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1A-DCN質(zhì)粒可上調(diào)MC內(nèi)DCN的mRNA和蛋白表達;使G0/G1期的細胞數(shù)明顯增多,S期的細胞數(shù)減少,提示MC生長受到抑制,且p21蛋白表達升高,EGFR蛋白表達降低;同時細胞凋亡率明顯升高,且活性caspase-3蛋白表達升高;TGF-β1的蛋白表達被明顯抑制。轉(zhuǎn)染DCNsiRNA可以下調(diào)MC內(nèi)DCN的蛋白表達,使

10、G0/G1期的細胞數(shù)減少,S期的細胞數(shù)增多,且p21蛋白表達降低,EGFR蛋白表達升高;同時細胞凋亡率降低,且活性caspase-3降低;TGF-β1的蛋白表達明顯升高。
　　小結(jié)：經(jīng)脂質(zhì)體介導法成功獲得穩(wěn)定高表達DCN基因的MC株(D19)。DCN可以通過活化caspase-3參與調(diào)控MC的凋亡,并能通過對EGFR和p21蛋白表達的影響,參與調(diào)控MC的生長,且DCN可有效調(diào)節(jié)MC內(nèi)TGF-β1的蛋白表達。
　　第二部分泛素

11、-蛋白酶體途徑介導MC內(nèi)DCN的降解過程
　　目的：明確大鼠腎MC內(nèi)DCN的降解途徑以及調(diào)控該途徑對DCN功能的影響。
　　方法：應用免疫共沉淀的方法在MC內(nèi)檢測DCN是否與泛素蛋白相結(jié)合;使用蛋白酶體抑制劑MG132或溶酶體抑制劑NH4Cl處理MC,應用免疫共沉淀檢測泛素化DCN水平及Western blot檢測細胞內(nèi)DCN蛋白總量;分別使用MG132和/或蛋白合成抑制劑cycloheximide(CHX)處理MC,用Ti

12、me-course western blot法檢測DCN半衰期;使用N-糖鏈抑制劑tunicamycin處理MC,應用免疫共沉淀檢測泛素化DCN水平及Western blot檢測細胞內(nèi)DCN蛋白總量;使用tunicamycin和/或CHX處理MC,用Time-course western blot檢測DCN半衰期;使用MG132或tunicamycin處理MC,用RT-PCR檢測DCN和ColⅣ的mRNA表達,Western blot檢

13、測DCN和TGF-β1的蛋白表達,流式細胞儀檢測細胞周期。
　　結(jié)果：MC內(nèi)DCN與泛素蛋白相結(jié)合,使用MG132可以顯著提高MC內(nèi)DCN的泛素化水平和蛋白總量,而應用NH4C1對DCN的泛素化水平和蛋白總量無明顯作用。使用CHX單獨處理的MC內(nèi)DCN的半衰期約為12h,聯(lián)合使用MG132后,DCN降解被阻斷,其半衰期明顯延長。使用tunicamycin可以提高細胞內(nèi)DCN的泛素化水平,促進DCN降解而降低DCN蛋白總量,以及使D

14、CN的半衰期明顯縮短,約為6h。經(jīng)MG132處理后,伴隨MC內(nèi)DCN蛋白表達升高,ColⅣ的mRNA表達降低,TGF-β1蛋白表達降低,同時G0/G1期的細胞數(shù)明顯增多;而經(jīng)tunicamycin處理后,伴隨MC內(nèi)DCN蛋白表達降低,TGF-β1蛋白表達則顯著升高。
　　小結(jié)：大鼠腎MC內(nèi)DCN主要通過泛素-蛋白酶體途徑降解,DCNN-糖鏈的合成抑制可促進其泛素化和降解,調(diào)控DCN的泛素化降解可影響ColⅣ的mRNA表達、TGF-

15、β1的蛋白表達和MC生長。
　　第三部分USP2-69對MC內(nèi)DCN泛素化降解過程的調(diào)節(jié)
　　目的：明確USP2-69對DCN泛素化降解過程的影響。
　　方法：采用Western blot法檢測大鼠MC、肝細胞株(BRL-3A)和足細胞(GEC)內(nèi)USP2-69的表達;分別采用免疫共沉淀和激光共聚焦顯微鏡觀察方法,檢測MC內(nèi)USP2-69是否與DCN結(jié)合,并觀察兩者在細胞內(nèi)的定位;純化pRK5-USP2-69-HA真核

16、表達質(zhì)粒及酶切鑒定;將pRK5-USP2-69-HA質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MC,應用Western blot的方法,分別檢測HA、USP2-69和DCN的蛋白表達,用免疫共沉淀的方法檢測MC內(nèi)DCN的泛素化水平。
　　結(jié)果：在MC內(nèi)USP2-69的蛋白表達高于BRL-3A和GEC。MC內(nèi)USP2-69可與DCN相互結(jié)合,且兩者在胞質(zhì)內(nèi)共定位。純化的pRK5-USP2-69-HA質(zhì)粒經(jīng)過BamHⅠ及HindⅢ雙酶切后得到約4600bp大小的p