核心蛋白聚糖(decorin)對兔耳創(chuàng)面愈合和瘢痕增生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、皮膚的創(chuàng)傷愈合過程分為炎癥反應(yīng)、組織增生和組織重塑三個階段,包括血管通透性增加、炎癥細(xì)胞浸潤、局部生長因子的分泌、上皮再生和基質(zhì)的沉積和重塑。在整個組織修復(fù)愈合過程中,涉及創(chuàng)面局部微環(huán)境中多種細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分、多種蛋白分子之間的相互制約和相互促進(jìn)作用。在這些過程中,有多種生長因子能在細(xì)胞浸潤、增殖,細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解等各個環(huán)節(jié)影響創(chuàng)傷愈合過程。如果創(chuàng)面過度愈合,則形成病理性瘢痕。
　　 皮膚創(chuàng)傷后病理性瘢痕的形成是臨床面

2、臨的難題之一,病理性瘢痕不僅帶來外觀上的畸形,嚴(yán)重者瘢痕大片增生孿縮可致功能障礙,并產(chǎn)生心理障礙。病理性瘢痕形成機(jī)制和防治的研究一直是整形外科的難題。盡管臨床醫(yī)生認(rèn)知一疾病的歷史非常久遠(yuǎn),采取了手術(shù)、藥物、放療、激光、冷凍、加壓等多種方法進(jìn)行單一或聯(lián)合治療,效果仍不理想。一般認(rèn)為,它是由于各種原因引起成纖維細(xì)胞異常增殖,膠原大量合成,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成分過度沉積所致。
　　 臨床上對于瘢痕的防治,主要是通過阻斷參與瘢痕組織形成過程

3、中的細(xì)胞和細(xì)胞因子的作用,抑制細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生和積聚。在創(chuàng)傷過度愈合,形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的過程中,轉(zhuǎn)移生長因子β1(TGF-β1)發(fā)揮著決定性的作用。TGF-β可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,抑制膠原降解。而單核、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞又能以自分泌的形式產(chǎn)生TGF-β1,維持著創(chuàng)傷局部TGF-β的濃度。在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)TGF-β1的高表達(dá)。在TGF-β1低表達(dá)的動物胚胎,其皮膚創(chuàng)傷后可以無

4、瘢痕愈合,而外源性地加入TGF-β1卻可以引起胎兒皮膚傷口的瘢痕形成。另外通過抑制TGF-β1的表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也能夠起到抑制瘢痕增生的作用。由此可見,TGF-β1的高表達(dá)是瘢痕增生的重要因素,阻斷TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)則可以作為抑制瘢痕增生的一個關(guān)鍵的切入點(diǎn)。
　　 核心蛋白聚糖(decorin)是細(xì)胞外基質(zhì)中一種富含亮氨酸的小分子蛋白多糖,由核心蛋白和一條糖胺聚糖(GAG)鏈構(gòu)成,其核心蛋白分子量約為40KD,以10-12個

5、富含亮氨酸重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?decorin因可結(jié)合在膠原纖維表面(decorating collagen fibers in vivo)而命名。研究證實(shí),decorin是正常真皮中含量最豐富的蛋白多糖,在非瘢痕愈合創(chuàng)面中,decorin表達(dá)早且豐富,在早期增生性瘢痕組織中decorin含量極低或無,而增生性瘢痕在成熟過程中又重新出現(xiàn)與正常真皮含量相當(dāng)?shù)膁ecorin。在深二度燒傷創(chuàng)面愈合形成的瘢痕研究中,真皮網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞合成d

6、ecorin能力低于乳頭層成纖維細(xì)胞,而成纖維細(xì)胞可能來源于組織損傷時真皮深部殘留的成纖維細(xì)胞,這些研究均表明decorin減少可能與增生性瘢痕形成有關(guān)。
　　 Decorin廣泛存在于多種結(jié)締組織中,具有多種生物學(xué)功能。現(xiàn)已證實(shí)decorin可與多種纖維膠原相互作用,尤其是與Ⅰ型膠原的相互作用研究最多。組織基質(zhì)中decorin可與Ⅰ型膠原結(jié)合,結(jié)合位點(diǎn)在d帶和e帶,其GAG側(cè)鏈垂直于膠原原纖維將相鄰的原纖維連接起來。因此dec

7、orin可能通過GAG鏈間形成的抗平行的雙螺旋結(jié)構(gòu),使膠原分子的側(cè)向裝配受限,從而調(diào)節(jié)膠原原纖維直徑,并保證膠原原纖維準(zhǔn)確裝配,形成膠原纖維及膠原纖維束。而敲除decorin基因的小鼠皮膚膠原纖維厚度不均,皮膚易碎。Decorin還可調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附,中和TGF-β1的活性。Decorin對TGF-β1的調(diào)節(jié)可能是因?yàn)榧?xì)胞因子與其結(jié)合后妨礙了細(xì)胞因子與細(xì)胞表面受體的結(jié)合,對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的生長因子起到隔絕作用。此外,decorin還

8、具有抗細(xì)胞增殖等作用。在體外實(shí)驗(yàn)中,decorin可抑制TGF-β1刺激正常皮膚和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與膠原合成的作用,進(jìn)一步采用三維膠原凝膠網(wǎng)格培養(yǎng)證實(shí)decorin可能對增生性瘢痕的攣縮具有抑制作用,表明decorin在預(yù)防增生性瘢痕形成和促進(jìn)瘢痕成熟中具有一定的作用。Decorin通過上述的一些途徑和機(jī)制在抗纖維化中作用明確,一些國家已經(jīng)嘗試將提取和人工合成的decorin通過適當(dāng)?shù)耐緩接糜趧游锖腿梭w進(jìn)行抗纖維化的治療,國內(nèi)也

9、有用decorin干預(yù)肌腱、結(jié)膜瘢痕、腎臟纖維化的成功實(shí)驗(yàn)報道。
　　 尋找和建立有效的瘢痕動物模型是瘢痕研究的基礎(chǔ),兔耳腹創(chuàng)面愈合后形成瘢痕,已得到整形界的認(rèn)可。目前國內(nèi)尚無關(guān)于通過兔耳瘢痕動物模型,觀察外源性decorin對增生性瘢痕作用的報道。本實(shí)驗(yàn)以兔耳增生性瘢痕為模型,給予外源性decorin,觀察其能否促進(jìn)創(chuàng)面愈合,預(yù)防瘢痕增生或促進(jìn)瘢痕成熟,以期為今后應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。本研究將分為二部分,第一部分建立兔耳增生

10、性瘢痕模型,在瘢痕形成早期,注射外源性decorin,觀察decorin是否可減輕瘢痕增生,促進(jìn)瘢痕軟化。第二部分則分別在兔耳創(chuàng)面愈合早期和后期,給予外源性decorin,觀察decorin是否可促進(jìn)兔耳創(chuàng)面的愈合和抑制瘢痕形成,并比較不同時期應(yīng)用后效果是否有差異性。
　　 第一部分瘢痕形成早期核心蛋白聚糖decorin對兔耳增生性瘢痕的抑制作用研究
　　 目的:建立兔耳瘢痕增生模型,于瘢痕形成后向瘢痕內(nèi)注射核心蛋白聚糖

11、decorin,觀察decorin對瘢痕增生是否有抑制作用,分析組織內(nèi)Ⅰ型膠原和TGF-β1蛋白合成和基因表達(dá)變化。
　　 方法12只新西蘭大白兔,隨機(jī)分成3組,實(shí)驗(yàn)組(DCN組)、對照組(PBS組)和空白對照組,每組4只。于耳腹做直徑8mm圓形創(chuàng)面,建立增生性瘢痕動物模型。觀察每組創(chuàng)面愈合和瘢痕形成情況,比較各組平均創(chuàng)面愈合時間和瘢痕形成率。術(shù)后第20天和第25天實(shí)驗(yàn)組行瘢痕內(nèi)注射10μg/ml核心蛋白聚糖decorin2次,

12、對照組注射PBS溶液2次,空白對照組不做任何處理。至術(shù)后30天(末次注射后5d),每組切取標(biāo)本30份。15份行HE染色和Ⅰ型膠原和TGF-β1免疫組織化學(xué)染色,比較各組瘢痕增生指數(shù)(SEI),Ⅰ型膠原蛋白和TGF—β1陽性染色平均吸光度差異。另15份標(biāo)本提取組織RNA,real-time PCR檢測各組增生性瘢痕中Ⅰ型前膠原和TGF-β1 mRNA表達(dá)2-ΔCt值。
　　 結(jié)果除感染創(chuàng)面外,術(shù)后15-17天大部分創(chuàng)面兔耳已愈合,

13、傷后20天左右瘢痕逐漸形成。增生瘢痕呈紅色或淡紅色,中央開始出現(xiàn)“小丘”樣凸起,高于皮面,瘢痕質(zhì)硬。觀察術(shù)后三組創(chuàng)面平均愈合天數(shù):DCN注射組15.79±1.393 d,PBS組15.602±1.389d,對照組15.772±1.389d;術(shù)后20天瘢痕形成率為DCN組80.492±3.731％,PBS組為79.659±3.222％,對照組為80.038±3.624％,采用單因素方差分析比較,三組創(chuàng)面平均愈合時間(F=0.253,P=0

14、.776)和瘢痕形成率(F=0.056,P=0.946)差異均無顯著性。
　　 術(shù)后30天(末次注射后5天)時,三組兔耳增生瘢痕差別明顯。PBS組和對照組增生瘢痕明顯高于周圍正常皮膚,中央呈“小丘”樣凸起明顯,局部質(zhì)地較硬,部分增生呈魚鉤狀彎曲,用手無法使其變形。DCN組瘢痕平坦,質(zhì)地大部較軟,只有中央增生部分質(zhì)地較韌,高出皮面,瘢痕表面呈淡粉紅色,周圍與正常皮膚接近。
　　 顯微鏡下可見,PBS注射組和對照組兔耳增生瘢

15、痕表皮層和真皮層均明顯增厚。真皮層內(nèi)可見大量排列無序的成纖維細(xì)胞,細(xì)胞核深染。成纖維細(xì)胞在真皮淺層排列混亂,呈漩渦或結(jié)節(jié)狀,在真皮深層排列規(guī)整?；|(zhì)中大量膠原沉積,排列呈結(jié)節(jié)或漩渦狀結(jié)構(gòu),并可見增生的毛細(xì)血管、血管內(nèi)紅細(xì)胞,及炎癥細(xì)胞浸潤。DCN組真皮層內(nèi)成纖維細(xì)胞排列較規(guī)則,胞核淡染,膠原形態(tài)纖細(xì),排列規(guī)整。毛細(xì)血管管腔部分閉塞,炎癥細(xì)胞浸潤不明顯。單因素方差分析術(shù)后30天,三組瘢痕增生指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.198,P=0

16、.000),DCN注射組瘢痕增生指數(shù)(1.716±0.290)顯著低于PBS組(2.785±0.435)和對照組(2.982±0.475),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),PBS組和對照組之間無顯著差異(P>0.05)。
　　 免疫組化染色結(jié)果顯示,Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)信號呈現(xiàn)棕黃色染色,主要位于細(xì)胞外基質(zhì)中,成纖維細(xì)胞胞漿也可表達(dá)。PBS組和對照組Ⅰ型膠原染色分布密集,粗大呈束狀,成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)著色較深,呈深棕黃色染色。

17、DCN組細(xì)胞外基質(zhì)中可見略加深染不規(guī)則的纖維網(wǎng)狀條索,分布稀疏,纖維較纖細(xì)。β1陽性表達(dá)信號主要定位于成纖維細(xì)胞胞漿中,細(xì)胞外基質(zhì)輕微淡染。PBS組和對照組中,成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)可見密集的棕黃色顆粒,或深染的棕黃色團(tuán)塊,質(zhì)地不均。DCN注射組中,單位面積內(nèi)陽性細(xì)胞個數(shù)明顯減少,胞漿著色不均,大部分陽性細(xì)胞胞漿淡染。計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽性信號的吸光度,表示Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,三組Ⅰ型膠原(F=25.690,

18、P=0.000)和TGF-β1(F=31.455,P=0.000)平均吸光度差異均具有顯著性。DCN組Ⅰ型膠原和TGF-β1吸光度均顯著低于PBS組(P均=0.000)和對照組(P均=0.000),差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PBS組和對照組之間Ⅰ型膠原和TGF-β1平均吸光度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 Real-time PCR以2-ΔCt值表示Ⅰ型前膠原和TGF-β1mRNA相對表達(dá)量。術(shù)后30天DCN

19、組中Ⅰ型前膠原和TGF-β1mRNA相對表達(dá)量均低于PBS組和對照組(P<0.05),差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PBS組和對照組之間無差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論本部分實(shí)驗(yàn)以兔耳增生性瘢痕為模型,于瘢痕形成早期行瘢痕內(nèi)注射decorin,證實(shí)外源性decorin可以減少細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅰ型膠原和TGF-β1的合成和mRNA的表達(dá),抑制瘢痕增生,促進(jìn)瘢痕成熟軟化。
　　 第二部分創(chuàng)面愈合期核心蛋白聚糖decorin對兔耳創(chuàng)

20、面愈合和瘢痕形成的影響研究
　　 目的:建立兔耳瘢痕模型,分別在創(chuàng)面愈合早期和愈合后期應(yīng)用外源性decorin,比較兔耳創(chuàng)面愈合、瘢痕形成和增生有無差異。
　　 方法:選擇15只新西蘭大白兔,于耳腹做直徑8mm圓形創(chuàng)面,每只12個創(chuàng)面,共180個創(chuàng)面。隨機(jī)分成3組,早期治療組(E-DCN組)、晚期治療組(L-DCN組)和空白對照組,每組5只。早期治療組(E-DCN組)術(shù)后第1、3、5天創(chuàng)面外涂和創(chuàng)周注射10μg/ml核心

21、蛋白聚糖decorin；晚期治療組于術(shù)后第9、11、13天創(chuàng)面及創(chuàng)周注射10μg/ml核心蛋白聚糖decodn；空白對照組創(chuàng)面暴露,自然愈合。記錄創(chuàng)面愈合時間及瘢痕形成情況,比較各組創(chuàng)面平均愈合時間和瘢痕形成率。于術(shù)后第7天和術(shù)后30天分別切取標(biāo)本20份,10份行HE染色和Ⅰ型膠原和TGF-β1免疫組織化學(xué)染色,比較瘢痕增生指數(shù)(SEI)(只用于術(shù)后30天標(biāo)本)、Ⅰ型膠原和TGF-β1表達(dá)平均吸光度。另10份標(biāo)本提取組織RNA,real

22、-time PCR檢測各組組織中Ⅰ型前膠原和TGF-β1 mRNA表達(dá)2-ΔCt值。
　　 結(jié)果:術(shù)后觀察三組創(chuàng)面平均愈合時間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=3.219,P=0.044),早期治療組為16.188±1.856d,較晚期治療組(15.338±1.618d)和對照組延長(15.388±1.569d),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。晚期治療組和對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后20天各組瘢痕形成率早期治療組為80±6.

23、847％,晚期治療組為85±5.590％,對照組為82.5±6.847％,三組間瘢痕形成率分別為無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.056,P=0.946)。
　　 顯微鏡下顯示,術(shù)后30天早期治療組和對照組瘢痕組織結(jié)構(gòu)無明顯的組織學(xué)差異。表皮明顯增厚,真皮層次紊亂,膠原纖維粗大,排列紊亂,可見漩渦狀膠原結(jié)節(jié),成纖維細(xì)胞數(shù)量較多,體積較大,微血管分布豐富,其間可見較多的炎細(xì)胞浸潤。晚期治療組瘢痕組織表皮略微增厚,真皮層較正常變厚,膠原纖維排列

24、略有序,成纖維細(xì)胞數(shù)增加,更接近正常皮膚結(jié)構(gòu)。瘢痕組織中微血管分布相對較少。測術(shù)后30天瘢痕增生指數(shù),晚期治療組SEI為1.951±0.312,低于早期治療組(2.770±0.519)和對照組(2.858±0.38),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均=0.000),早期治療組和對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 免疫組化染色結(jié)果顯示,術(shù)后第7天三組肉芽組織中Ⅰ型膠原(F=3.395,P=0.048)和TGF-β1(F≈9.5

25、82,P=0.001)平均吸光度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。早期治療組Ⅰ型膠原和TGF-β1吸光度均低于晚期治療組(P=0.025,P=0.001)和對照組(P=0.044,P=0.001),晚期治療組和對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后第30天三組瘢痕組織中晚期治療組Ⅰ型膠原和TGF-β1吸光度則均低于早期治療組和對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),早期治療組和對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 以2-

26、ΔCt值表示Ⅰ型前膠原和TGF-β1 mRNA表達(dá)量,術(shù)后第7天早期治療組中Ⅰ型前膠原mRNA水平為1.196±0.310,較晚期治療組(1.6199±0.380)和對照組(1.747±0.486)顯著減少(P<0.05),晚期治療組和對照組相比無顯著差異(P>0.05)。至術(shù)后30天,三組Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)2-ΔCt值均較術(shù)后7天顯著增加(P<0.05),早期治療組升高達(dá)3.926±0.969,晚期治療組為2.677±0.519,

27、對照組為4.012±0.797。術(shù)后30天組間比較,晚期治療組Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)水平顯著低于早期治療組和對照組(P<0.05),早期治療組和對照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 術(shù)后第7天早期治療組中TGF-β1 mRNA水平為0.025±0.087,較晚期治療組(0.067±0.022)和對照組(0.061±0.020)顯著減少(P<0.05),晚期治療組和對照組相比無顯著差異(P>0.05)。術(shù)后30天,早期治療

28、組TGF-β1 mRNA表達(dá)2-△Ct值較術(shù)后7天顯著增加,為0.080±0.029,晚期治療組TGF-β1 mRNA水平則下降為0.038±0.012,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后30天對照組TGF-β1 mRNA為0.074±0.032,雖與術(shù)后7天相比有增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后30天組間比較,晚期治療組表達(dá)水平低于早期治療組(P=0.004)和對照組(P=0.014),差異有顯著性。早期治療組和對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

29、異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:外源性decorin應(yīng)用于兔耳創(chuàng)面愈合的不同時期,均可減少組織中Ⅰ型膠原和TGF-β1的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)水平。
　　 兔耳創(chuàng)面愈合早期(創(chuàng)面上皮開始形成之前)給予外源性decorin延長創(chuàng)面愈合時間,沒有進(jìn)一步抑制瘢痕形成和增生的作用。兔耳創(chuàng)面愈合晚期(創(chuàng)面上皮開始形成之后)給予外源性decorin對創(chuàng)面愈合時間和瘢痕形成率無影響,可抑制創(chuàng)面愈合后瘢痕進(jìn)一步增生。
　　 在以拮